泛素连接酶Cbl-b基因短发卡RNA慢病毒载体构建及其对A375细胞生物学行为的影响

摘要：

目的 构建人泛素连接酶Cbl-b基因短发卡RNA(shRNA)重组慢病毒载体,探讨其对人黑素瘤A375细胞生物学行为的影响.方法 设计并合成3条沉默Cbl-b基因的特异性shRNA及1条阴性对照shRNA,构建慢病毒载体.将A375细胞分成5组,即分别用3条特异性shRNA转染的CBLB-shRNA-1组、CBLB-shRNA-2组、CBLB-shRNA-3组,阴性对照组(阴性对照shRNA转染),空白对照组(转染空载体).应用实时荧光定量PCR和Western印迹检测转染后72 h各组A375细胞沉默效率;CCK8法检测转染后24、48、72及96 h细胞增殖能力;流式细胞仪检测转染后72 h细胞凋亡情况、细胞周期,Transwell法检测转染后72 h细胞侵袭能力.结果 成功构建3条Cbl-b shRNA慢病毒载体,Western印迹示CBLB-shRNA-3蛋白沉默效率最高.CCK8检测表明,CBLB-shRNA-3组A375细胞增殖能力在转染后72 h和96 h较阴性对照组、空白对照组明显降低(均P＜0.01).流式细胞仪检测示,CBLB-shRNA-3组凋亡率[(22.73±6.58)％]明显高于阴性对照组[(6.08±1.35)％]和空白对照组[(6.34±1.07)％,均P＜0.01].CBLB-shRNA-3组G1期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜ 0.01),而S期细胞比例明显低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.01).Transwell检测示,阴性对照组、空白对照组和CBLB-shRNA-3组转染后72 h时穿膜细胞数分别为76.60±1.82、73.20±3.83、19.60±1.14,差异有统计学意义(F=794.50,P＜0.01).结论 成功构建能高效沉默Cbl-b蛋白的CBLB-shRNA-3重组shRNA慢病毒载体,其可促进A375细胞凋亡,抑制A375细胞增殖、细胞周期进程和侵袭能力.

关键词：黑素瘤、原癌基因蛋白质c-cbl、RNA、小分子干扰、细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、基因、Cbl-b、A375细胞、短发卡RNA

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资助基金：国家自然科学基金81272992;北京协和医学院研究生创新基金2015-1002-01-12;中国医学科学院医学创新基金IFMS-2017-12M-1-017National Natural Science Foundation of China81272992;Graduate Innovation Fund of Peking Union Medical College2015-1002-01-12;CAMS Innovation Fund for Medical SciencesIFMS-2017-I2M-1-017

在线出版日期：2018-05-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：177-181