10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.08.011
shRNA沉默神经导向分子5A基因对A375细胞系增殖、转移和侵袭能力的影响
目的:探讨慢病毒介导短发夹RNA(shRNA)沉默神经导向分子5A(Semaphorin 5A)基因对恶性黑素瘤A375细胞系生物活性的影响。方法针对Semaphorin 5A设计2对shRNA引物及1对阴性对照引物,构建慢病毒载体,转染至人胚肾上皮HEK293T细胞系收获慢病毒,利用慢病毒感染A?375细胞系并通过嘌呤霉素筛选,成功获得稳定转染细胞系,实验分为实验组细胞(A375?shRNA1和A375?shRNA2)、阴性对照组细胞(A375?con)及空白对照组细胞(A375)。通过反转录PCR(RT?PCR)、Western印迹比较实验组细胞、阴性对照组细胞及空白对照组细胞Semaphorin 5A mRNA、蛋白表达水平的差异。噻唑蓝(MTT)检测细胞生长情况;侵袭试验及划痕试验比较转染前后细胞的侵袭运动能力。结果 Semaphorin 5A成功转染A375细胞后,经嘌呤霉素筛选,成功获得稳定转染实验组A375?shRNA2细胞系及对照组A375?con。反转录PCR及Western印迹检测,干扰后实验组A375?shRNA2较对照组A375?con、A375 Semaphorin 5A的转录水平及蛋白表达水平表达下调。MTT实验结果显示,A375?con与A375细胞生长差异无统计学意义(P>0.05),A375?shRNA2细胞生长明显减慢,与A375和A375?con比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。划痕实验结果显示,A375?shRNA2划痕处细胞无明显迁移,划痕未得到修复,而A375及A375?con划痕处细胞最终几乎将划痕覆盖。侵袭实验结果显示,A375组与A375?con组穿过的细胞数差异无统计学意义(P>0.05);而A375?shRNA2通过小室的细胞明显少于A375及A375?con组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导shRNA沉默Semaphorin 5A基因能使A375中的Semaphorin 5A有效下调,并抑制细胞的生长,降低细胞的侵袭以及运动能力。
黑色素瘤、Semaphorin 5A、慢病毒属、RNA、小分子干扰、肿瘤侵润
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R73;R39
云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项2013FB138
2016-08-15(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)
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