人 GJB6基因 Tet-on HaCaT 细胞稳定株的构建与鉴定

摘要：

目的：以 Tet-on 慢病毒为载体建立稳定表达 GJB6基因及其突变体的 HaCaT 细胞株，为后续研究有汗性外胚层发育不良的发病机制奠定实验基础。方法利用 PCR 技术扩增人 GJB6基因野生型与突变型（A88V）基因，重组 Tet-on 慢病毒质粒，经基因测序及酶切技术对其鉴定，再将重组慢病毒转染入 HaCaT 细胞，经嘌呤霉素筛选出稳定表达编码缝隙连接蛋白 Cx30的 GJB6基因的细胞株。细胞株加四环素诱导后，通过 RT-PCR 检测 GJB6基因的 mRNA 表达量，同时通过 Western 印迹检测 Cx30与 FLAG 标签肽的表达，从而对稳定表达 GJB6基因的 HaCaT 细胞株进行鉴定。用 CCK8法检测 GJB6基因野生型与突变型经四环素诱导表达后对细胞增殖的影响。结果经酶切、测序鉴定，重组慢病毒质粒构建成功。RT-PCR 检测到稳定转染的 HaCaT 细胞中 GJB6基因 mRNA 表达量明显增加，感染野生型 Tet-on 慢病毒的 HaCaT 细胞组（WT 组）加四环素 GJB6基因表达丰度是 WT 组不加四环素的113.369倍（P ＜0.05），感染突变型（A88V）Tet-on 慢病毒的 HaCaT 细胞组（MU组）加四环素 GJB6基因表达丰度是 MU 组不加四环素的3.249倍（P ＜0.05）；Western 印迹可检测到经四环素处理的 WT 组和 MU 组稳定表达 Cx30与 FLAG，而未经四环素处理的细胞和感染阴性对照病毒的 HaCaT 细胞组（NC 组）未检测到 Cx30与 FLAG 目的条带。NC 组加与不加入四环素在4、8、12、24、36、48 h 时的 A 值差异均无统计学意义（P ＞0.05）；WT 组加与不加入四环素在4、8、12、24、36 h 时的 A 值差异均有统计学意义（P ＜0.05）；MU 组加与不加入四环素在4、8、12、24、36、48 h 时的 A 值差异均有统计学意义（P ＜0.05）。结论成功构建出稳定表达 GJB6基因野生型及其突变体 A88V 的 HaCaT 细胞株。

关键词：外胚层发育不良症、连接蛋白类、GJB6 基因、HaCaT 细胞、Tet-on

所属期刊栏目：49

分类号：R37;R57

资助基金：国家自然科学基金81171492；山东省自然科学基金ZR2011HQ056；山东省科技发展计划项目2010GSF10812、2011GSF11847

在线出版日期：2016-05-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：265-270