慢病毒载体介导人非小细胞肺癌A549细胞Akt2基因靶向抑制

摘要：

目的 通过构建慢病毒shRNA表达载体,靶向抑制Akt2基因的表达,获得稳定干扰Akt2基因的细胞克隆,为进一步探讨Akt2的功能奠定基础.方法 设计并合成针对Akt2靶基因的双链寡核苷酸序列,经退火、酶切、连接反应,将干扰序列插入pGCsil-GFP质粒,经感受态细胞转化、阳性克隆测序鉴定所插入的片段,经转染及慢病毒包装,收集浓缩病毒进行滴度测定,感染至人肺腺癌细胞A549,通过无菌流式细胞分选GFP强阳性细胞,并应用荧光定量PCR及Western-blot验证干扰效果.结果 重组pGCsil-shAkt2-GFP质粒载体经阳性克隆测序鉴定显示插入序列与shAkt2干扰序列完全符合,测定重组慢病毒vshAkt2滴度为3E+9TU/ml.重组慢病毒shAkt2感染A549细胞,经流式细胞术分选90.1% GFP为强阳性细胞群.通过qRT-PCR与western blot检测Akt2 mRNA及蛋白表达水平,提示与正常对照组比较,shAkt2组细胞中Akt2 mRNA水平下降63.39%,蛋白水平减少91.56%.结论 本研究所构建的慢病毒shAkt2表达载体,能够在A549细胞内稳定、有效的抑制靶基因Akt2的表达,为深入研究Akt2在非小细胞肺癌(NSCLC)中的作用奠定了基础.

关键词：非小细胞肺癌、Akt2、RNA干扰、慢病毒载体

所属期刊栏目：4

分类号：R734.2(肿瘤学)

在线出版日期：2012-02-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：454-461