10.16839/j.cnki.zgcy.2018.04.007
一种家蚕丝腺体外培养和基因瞬时表达分析的方法
家蚕是鳞翅目重要的模式生物,但是目前家蚕培养细胞系少,给家蚕基础研究带来不便,也影响了家蚕作为模式生物的应用.组织体外培养在一定程度上可以代表体内环境,且操作相对简单.我们尝试并建立了一种采用TC-100培养基体外培养丝腺组织的方法,取健康家蚕5龄2d的幼虫,用75％乙醇进行表面消毒,灭菌水冲洗,剪开腹部表皮固定,用镊子轻轻拉出丝腺组织,用75％乙醇快速漂洗、PBS缓冲液冲洗2～3次,放入含有800 μLTC-100培养基的12孔细胞培养板的培养孔中,每孔4条丝腺组织,27℃培养;将0.64 μg增强荧光蛋白基因表达载体pcDNA3.0[iel-egfp-SV40]加入到25 μL不完全TC-100培养基中孵育15 min后转染丝腺组织,48 h后用荧光显微镜观察,培养基清澈,丝腺组织外形完好、发出亮绿色荧光,表明egfp在丝腺中得到了表达.为进一步验证体外培养丝腺的转染效果,将家蚕miR-0031*的抑制物(inhibitor)和阴性对照(inhibitor negetive control)各10 μL按照同样方法配成转染液,加入到放有丝腺组织的培养孔中,48 h收集丝腺组织,提取总RNA,荧光定量PCR检测靶基因BmFib-L的表达量,结果显示,inhibitor抑制miR-0031*的表达,促使BmFib-L的表达量上升,表明用体外培养丝腺进行转染等试验是可行的.该方法的建立为研究蚕丝蛋白基因表达调控的分子机制提供新的技术途径,也为家蚕其他组织的体外培养和研究提供借鉴.
家蚕、丝腺、体外培养、转染、瞬时表达
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S881.2(蚕桑)
国家自然科学基金项目编号31672490,31172266;江苏省自然科学基金项目编号BK20151322;江苏省高校自然科学研究重大项目编号15KJA180001
2018-12-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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