细胞色素氧化酶2E1基因沉默对三氯乙烯致L02肝细胞毒性的影响

摘要：

目的 通过RNA干扰技术,构建细胞色素氧化酶(CYP)2E1基因慢病毒表达载体,研究CYP2E1基因沉默对三氯乙烯(TCE)致肝细胞毒性的影响.方法 设计合成shRNA片段连接到慢病毒载体,筛选单菌落,经聚合酶链式反应(PCR)和测序鉴定后提取质粒,转导L02肝细胞中,筛选CYP2E1缺陷型细胞,利用荧光定量PCR和免疫蛋白印迹法(Western blot)鉴定干扰效果.以不同浓度(0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mmol/L)TCE分别对L02肝细胞和CYP2E1基因沉默细胞染毒,测定TCE对2种细胞的存活率及IC50,应用流式细胞仪测定细胞凋亡率,采用实时荧光定量PCR检测细胞凋亡基因和癌基因mRNA表达水平.结果 正常L02肝细胞对TCE的IC50为15.1 mmol/L,CYP2E1沉默细胞对TCE的IC50为23.6 mmol/L.随TCE剂量增加两组细胞凋亡率升高,2.0、4.0 mmol/L TCE染毒剂量时,CYP2E1沉默细胞的凋亡率明显低于L02肝细胞组,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).TCE染毒后CYP2E1沉默细胞的抗凋亡基因Bcl-2表达水平比L02肝细胞升高15％～60％,凋亡基因caspase-3和caspase-9表达水平比L02肝细胞下降30％～60％,差异均有统计学意义(P＜0.01).抑癌基因p53表达水平明显高于L02肝细胞,升高81％～278％;癌基因c-fos和k-ras明显低于L02肝细胞组,下降20％～68％,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 利用慢病毒介导RNA干扰技术成功构建了CYP2E1基因沉默细胞.沉默CYP2E1基因可降低TCE对肝细胞毒性,抑制部分凋亡基因与癌基因表达,提示CYP2E1基因在三氯乙烯代谢过程中发挥重要作用,与三氯乙烯毒性存在一定关系.

关键词：三氯乙烯、细胞色素氧化酶2E1、RNA干扰、慢病毒载体、基因沉默

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资助基金：深圳市科技计划重点项目201101015

在线出版日期：2013-05-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：172-177