干扰素调节因子3引导RNA真核表达载体的构建

摘要：

目的 通过构建干扰素调节因子3(IRF3)gRNA真核表达载体,研究IRF3介导的转录非依赖性细胞凋亡的分子机制.方法 通过分析IRF3的分子结构,在CHOPCHOP网站设计IRF3分子gRNA的序列,并在pLenti-U6-gRNA-PGK-Neo表达载体上ClaI和NheI限制性内切酶的位点处设计两对引物,通过重叠延伸PCR法扩增生成IRF3 gRNA的表达模块,通过TA克隆的方法构建到pGM-simpleT克隆载体中,然后用双酶切的方法将IRF3 gRNA的表达模块亚克隆构建到表达载体中,通过PCR和Sanger测序的方法筛选并鉴定pLenti-U6-IRF3-gRNA表达载体.结果 在IRF3的BH3样结构域和C端磷酸化结构域之间获得IRF3的gRNA序列.通过重叠延伸PCR扩增得到IRF3 gRNA的表达模块,通过TA克隆得到克隆载体pGM-simple T-IRF3-gRNA.通过双酶切的方法,将IRF3 gRNA表达模块亚克隆至pLenti-U6-gRNA-PGK-Neo真核表达载体,通过Sanger测序鉴定最终得到pLenti-U6-IRF3-gRNA表达载体.结论 通过重叠延伸法成功构建pLenti-U6-IRF3-gRNA表达载体,为研究IRF3诱导细胞凋亡的转录非依赖性分子机制奠定了基础.

关键词：干扰素调节因子3、重叠延伸PCR、CRISPR-Cas9、引导RNA

所属期刊栏目：10

分类号：Q78;R735.2;S663.1

资助基金：山东省医药卫生科技发展计划项目;国家自然科学基金;国家级大学生创新创业训练计划项目

在线出版日期：2023-02-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：215-221