通过慢病毒载体构建SSA/Ro52稳定基因沉默细胞系

摘要：

目的：利用慢病毒载体持续表达RNA干扰序列抑制基因表达，建立SSA/Ro52稳定基因沉默细胞系，为进一步研究SSA/Ro52的功能提供有效工具。方法4条SSA/Ro52特异序列（克隆1为TGGCATGGTCTCCTTCTACAA，克隆2为CTGCCTTCTTTATGGGACTTA，克隆9为TGAGAAGTTGGAAGTGGAAAT，克隆11为AGTTATCCTATGGTCCTGGGT）和无关对照序列克隆至慢病毒载体pLKO-puro，表达后可形成小发卡结RNA（small hair-pin，shRNA），通过RNA干扰机制抑制特异基因表达。表达SSA/Ro52特异序列的克隆1、2、9、11以及表达无关序列的对照克隆（scramble，S）分别与包装载体pGag-Pol和pVSV-G共同转染293T细胞，收集含病毒颗粒的培养液。用表达SSA/Ro52特异序列和无关对照序列的病毒颗粒感染Hela细胞，抗生素筛选，建立稳定细胞系。以GAPDH为内对照定量实时PCR检测SSA/Ro52 mRNA的表达。免疫印记检测SSA/Ro52蛋白，扫描SSA/Ro52条带与β-actin条带相比为SSA/Ro52蛋白的相对表达水平。克隆1、2、9、11转染细胞中SSA/Ro52的表达水平与对照克隆S的比值为基因表达的抑制程度。结果慢病毒颗粒可以有效感染Hela细胞，含shRNA表达框架的病毒序列可以整合至细胞基因组，形成稳定细胞系。克隆1、2、9、11转染细胞在抗生素筛选3 d后，其SSA/Ro52 mRNA表达水平分别是克隆S转染细胞的25．5％、31．2％、13．0％和77．2％；而上述克隆转染细胞SSA/Ro52蛋白表达水平是对照的5％、50％、10％和80％。培养4周后上述克隆SSA/Ro52蛋白表达水平没有明显变化。但用干扰素α刺激细胞后，SSA/Ro52在对照克隆转染细胞中表达增加，而克隆1、2、9、11转染细胞SSA/Ro52的表达是对照的30％、70％、5％和100％。结论克隆1、2、9可以有效抑制SSA/Ro52的表达，通过慢病毒载体转染细胞建立了SSA/Ro52稳定基因静默细胞系。在SSA/Ro52表达被上调时，克隆9仍然可以有效抑制SSA/Ro52的表达，为进一步研究SSA/Ro52的功能打下了基础。

关键词：SSA/Ro52、自身抗原、RNA干扰、慢病毒载体、细胞系

分类号：R593.2(全身性疾病)

资助基金：国家自然科学基金30840071，81373196

在线出版日期：2014-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：216-220,264