牙龈卟啉单胞菌W83牙龈蛋白酶的提取、鉴定及对人成骨细胞增殖、凋亡的影响

摘要：

目的 研究提纯并鉴定牙龈卟啉单胞菌(P.g)W83 牙龈蛋白酶的方法,探讨牙龈蛋白酶对人成骨细胞系hFOB 增殖及凋亡的影响.方法 丙酮沉淀P.g W83 上清,经重悬、透析、超滤提取牙龈蛋白酶;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分离牙龈蛋白酶条带;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱/源后衰变法(MALDI-TOF-MS/MS+MS)鉴定牙龈蛋白酶提取物;底物发色法测定牙龈蛋白酶活性;牙龈蛋白酶与人成骨细胞系hFOB 1.19共培养,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)或CCK-8 检测细胞凋亡或增殖.结果 P.g W83 牙龈蛋白酶提取物经SDS-PAGE 分离出50 kDa 蛋白条带,MALDI-TOF-MS/MS+MS 鉴定其为精氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Rgps).底物发色法测定Rgps、赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Kgp)活性分别为75.62、10.51 U/L,5 mmol/L 半胱氨酸蛋白酶抑制剂TLCK 对Rgps、Kgp 活性抑制分别为99.51%、99.00%(P ＜ 0.01).牙龈蛋白酶(Rgps 活性15.12 U/L、Kgp 活性2.10 U/L)与hFOB 共培养8 h 可诱导细胞发生凋亡,出现典型的细胞核染色质凝聚,且随时间增加hFOB 凋亡率逐渐上升,16 ～ 24 h 达到高峰.CCK-8 法检测显示,牙龈蛋白酶呈时间依赖性抑制hFOB 增殖.结论 丙酮沉淀P.g W83 上清,经重悬、透析、超滤提纯的牙龈蛋白酶主要成分是Rgps;底物发色法测定Rgps/Kgp 活性,方法稳定、可靠;牙龈蛋白酶抑制hFOB增殖且促进凋亡.

关键词：牙龈卟啉单胞菌、牙龈蛋白酶、成骨细胞

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分类号：R78;R44

资助基金：国家自然科学基金81170970;留学回国人员科研启动基金教启2009-134;广东省科技计划2011B031800259

在线出版日期：2013-09-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：305-311