小鼠成骨细胞中分泌型卷曲相关蛋白1转录后调控机制的研究

摘要：

目的 构建小鼠分泌型卷曲相关蛋白1 (secreted frizzle-related protein 1,SFRP1)基因3非编码区(untranslated regions,UTR)荧光素酶报告基因载体,探讨小鼠前成骨细胞系(MC3T3-E1)中SFRP1基因表达是否在转录后的翻译水平受到调控.方法 使用含50 mg/L抗坏血酸的成骨诱导液分别处理MC3T3-E1细胞0、7、10d,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶和β-肌动蛋白为内参,应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测细胞中SFRP1基因mRNA和蛋白的相对表达水平.使用PCR技术克隆SFRP1基因的3UTR区,连接到荧光素酶报告基因载体pMIR-REPORT上,构建的新载体命名为pMIR-REPORT-SFRP1UTR.分别将pMIR-REPORT-SFRP1UTR和pMIR-REPORT转染至MC3T3-E1细胞和小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)中,检测细胞中荧光素酶的表达水平.其中转染pMIR-REPORT-SFRP1UTR的细胞为pMIR-REPORT-SFRP1UTR组,转染pMIR-REPORT的细胞为pMIR-REPORT组.结果 成骨诱导0、7及10d后细胞中SFRP1的mRNA水平分别为1.00±0.12、1.97±0.34和4.98±0.99,诱导10d与0d相比差异有统计学意义(P＜0.05).成骨诱导0、7及10d后细胞中SFRP1的蛋白水平分别为0.94±0.13、1.26±0.16及1.30±0.15,诱导7、10d与0d相比差异均无统计学意义(P＞0.05).MC3T3-E1细胞pMIR-REPORT转染组和pMIR-REPORT-SFRP1UTR转染组的荧光素酶表达量分别为487±34和74± 10,二者差异有统计学意义(P＜0.05).NIH3T3细胞pMIR-REPORT转染组和pMIR-REPORT-SFRP1UTR转染组的荧光素酶表达量分别为2 707±117和2 240± 175,二者差异亦有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建了编码SFRP1基因3”UTR区的荧光素酶表达载体.SFRP1基因的3UTR区参与了SFRP1基因的转录后调控,且这种调控具有一定的细胞特异性.

关键词：基因表达调控、聚合酶链反应、分泌型卷曲相关蛋白1、成骨分化

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资助基金：国家自然科学基金81100757;National Natural Science Foundation of China81100757

在线出版日期：2016-05-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：242-247