结核分枝杆菌蛋白Rv0309通过蛋白STUB1抑制巨噬细胞自噬对耻垢分枝杆菌胞内存活的影响

摘要：

目的:探讨结核分枝杆菌（MTB）蛋白Rv0309促进耻垢分枝杆菌（Ms）在巨噬细胞胞内存活的分子调节机制。方法:以Ms为研究结核分枝杆菌的模型，构建带有对照组pMV261-3*flag空载质粒和实验组pMV261-Rv0309-3*flag质粒的重组Ms并感染RAW264.7细胞。通过计数菌落形成单位（CFU），探索蛋白Rv0309对Ms胞内存活的影响。通过质谱法筛选蛋白Rv0309与宿主相互作用的蛋白，采用免疫共沉淀法（Co-IP）验证宿主蛋白STUB1可与蛋白Rv0309相互作用。敲减RAW264.7细胞
STUB1基因后感染Ms，计数CFU，探索
STUB1基因敲减后，蛋白Rv0309对Ms胞内存活的影响。敲减RAW264.7细胞
STUB1基因后感染Ms，收样后进行Western blot实验，探索
STUB1基因敲减后，蛋白Rv0309对巨噬细胞自噬功能的影响。使用GraphPad Prism 8 软件进行统计分析，本实验选择
t检验进行分析，以
P<0.05为差异有统计学意义。
结果:Western blot显示蛋白Rv0309表达于耻垢分枝杆菌体内并分泌到胞外。感染THP-1巨噬细胞实验在24 h时实验组Ms-Rv0309的CFU高于对照组Ms-pMV261，差异有统计学意义（
P<0.05）。感染RAW264.7巨噬细胞实验结果趋势与感染THP-1巨噬细胞相同。免疫共沉淀（Co-IP）结果显示免疫沉淀（IP）：Flag和IP：HA结果中出现对应的Flag和HA条带。敲减
STUB1的实验组（siRNA-
STUB1组）CFU水平显著高于未敲减
STUB1对照组（NC组）CFU；与对照组Ms-pMV261相比，Ms-Rv0309组CFU均显著高于Ms-pMV261组。实验组Ms-Rv0309的LC3Ⅱ条带在对应时间灰度均浅于对照组Ms-pMV261，8 h时结果最显著（LC3Ⅱ/β-actin：0.76±0.05 vs 0.47±0.07），差异有统计学意义（
P<0.05）。siRNA-
STUB1组LC3Ⅱ条带在对应时间灰度均浅于NC组；对比Ms-pMV261和Ms-Rv0309菌株感染的CFU结果发现，与Ms-pMV261组相比，在对应时间LC3Ⅱ条带灰度Ms-Rv0309组更浅。
结论:MTB蛋白Rv0309能够成功表达于耻垢分枝杆菌并分泌到胞外，可抑制巨噬细胞的自噬过程。蛋白Rv0309与宿主蛋白STUB1相互作用，抑制巨噬细胞自噬促进Ms胞内存活。

关键词：分枝杆菌，结核、分枝杆菌，耻垢、自噬、蛋白Rv0309、蛋白STUB1

所属期刊栏目：46

资助基金：北京市临床重点专科项目20201214;北京市自然科学基金7232060;Beijing Key Clinical Specialty Project20201214;Beijing National Science Foundation7232060

在线出版日期：2023-05-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：396-403