藤黄微球菌复苏促进因子结构域及其突变体基因的克隆和表达及生物活性的测定

摘要：

目的 克隆、表达藤黄微球菌复苏促进因子(Rpf)结构域及其突变体基因,评价其生物学活性.方法 采用PCR方法从藤黄微球菌基因组中扩增出Rpf结构域及其突变体基因E54A、E54K,用限制性内切酶消化后克隆入pMD-18T载体中,将测序正确的基因插入到pGEx-4T-1表达载体中,转化大肠杆菌DH5α,经异丙基-B-D硫代半乳糖(IPTG)诱导,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达蛋白,利用Rpf结构域单克隆抗体进行Western blot分析.用GS-4B亲和层析柱纯化蛋白,将纯化的蛋白加人到休眠的耻垢分枝杆菌中测定各自的生物活性.结果 获得藤黄微球菌Rpf结构域及其E54K和E54A突变体基因,测序结果 与美国基因序列数据库GenBank公布的序列完全相同,突变位点与设定一致;表达蛋白相对分子质量与文献报道一致;Western blot结果 显示,在相对分子质量约32 000处有与Rpf结构域单克隆抗体特异性结合带.通过GS-4B系统,得到纯化的GST融合蛋白,并证实Rpf结构域蛋白对休眠的耻垢分枝杆菌有一定的复苏和促生长作用,突变体E54K对耻垢分枝杆菌的生长有抑制作用.结论 获得Rpf结构域及其2种突变体蛋白,明确其对耻垢休眠菌有复苏的作用.

关键词：分枝杆菌、耻垢、微球菌、藤黄、Rpf结构域、突变体、生物学活性

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分类号：R5(内科学)

资助基金：国家高技术研究发展计划863计划2007AA02ZA73;国家自然科学基金30670116;陕西省自然科学基金2006C218

在线出版日期：2008-12-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：761-765