弥漫性特发性骨质增生症骨化相关特异性miRNAs分析

摘要：

目的 三维黏附培养下获得并分析弥漫性特发性骨质增生症(diffuse idiopathic skeletal hyperostosis,DISH)骨化相关特异性miRNAs.方法 2012年1月至2014年1月通过手术分别获取4份DISH患者骨化黄韧带组织块与4份创伤患者正常黄韧带组织块,采用胶原酶消化法分离组织块中成纤维细胞,在人完全脱细胞羊膜(human acellular amniotic membrane,HAAM)上培养,收获前进行细胞免疫荧光鉴定;提取细胞总RNA并检测其质量,通过YM-100 (Millipore)微离心过滤柱得到片段＜ 300 nt的小RNA,采用μParafloTM miRNA微阵列基因表达实验和分析技术分析miRNAs表达谱,对结果中部分差异miRNAs进行qRT-PCR验证;采用PicTar 2005、miRanda v5、TargetScan 5.1软件预测靶基因;使用Gene Ontology进行靶基因功能注释,基于KEGG Pathway数据库分析靶基因所参与的骨化相关信号传导通路;使用TRANSFAC 7.0public转录因子数据库及Patser预测程序预测转录因子结合位点.结果 成纤维细胞在HAAM上生长时形态保持良好,呈簇状分布,复层生长并建立起细胞间联系;免疫荧光鉴定发现DISH组细胞骨钙素和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原呈阳性,正常组细胞Ⅰ和Ⅲ型胶原呈阳性;共获得15种信号比值＞1.5倍差异表达的miRNAs,12种上调、3种下调,qRT-PCR验证结果与微阵列芯片检测结果一致;共预测出67个靶基因,影响细胞分化、黏附及矿物质沉积等活动,参与MAPK、Wnt、TGF-β、Focal adhesion等多个骨化相关信号途径,预测出10种差异性miRNAs的转录因子.结论 HAAM可实现成纤维细胞在体外三维黏附下生长,部分miRNAs的异常表达可能参与DISH发病.

关键词：微RNAs、黄韧带、骨化、异位性、微阵列分析

所属期刊栏目：35

分类号：R3;R744.7;TP391

资助基金：国家自然科学基金;国家自然科学基金

在线出版日期：2015-01-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：68-75