新生大鼠海马神经元细胞体外培养方法改良研究

摘要：

目的：探讨改良的新生大鼠海马神经元细胞体外培养方法，为新生儿缺血性脑损伤模型等海马神经元相关疾病研究奠定基础。方法采用本研究自行设计的改良新生大鼠海马神经元细胞的体外培养方法，进行新生大鼠海马神经元细胞的体外培养。判断新生大鼠原代海马神经元细胞体外培养成功的标准为：荧光显微镜下，可见微管相关蛋白(MAP)2在海马神经元细胞体和树突中表达。该改良方法具体为：①以 L-多聚赖氨酸和鼠尾胶原作为神经元细胞体外培养的生长基质，分离出生24 h 内新生 SD 大鼠海马结构。将其运用单一胰蛋白酶水浴振荡消化后，吹打成细胞悬液，将海马神经元细胞以适当的密度种植于含10%胎牛血清 DMEM 培养基中，贴壁培养4 h 后，更换为Neurobasal 维持培养基继续培养，以后每3 d 更换1/2培养液。②采用抗 MAP2-5-异硫氰酸荧光素(anti-MAP2-FITC)免疫荧光法，对所获得的海马神经元细胞进行鉴定。结果①新生大鼠海马神经元细胞的体外培养结果显示，新生大鼠海马神经元细胞于培养30 min 时，大部分细胞贴壁生长，培养2 h 后，细胞贴壁明显，少数细胞开始长出突起。于培养5 d 后，神经元突起进一步增多，并形成神经细胞网络，培养7 d 后，神经元细胞分化更加成熟，神经元细胞之间的突起联系更加紧密，可见密集的神经细胞网络。海马神经元细胞体外培养至第21天后，神经元细胞开始退化、变性，细胞体皱缩，残留细胞体痕迹，周围光晕消失，折光性减弱，突起融合而粗大杂乱，神经细胞网络粗大老化。②anti-MAP2-FITC免疫荧光法对所获得的海马神经元细胞进行鉴定的结果显示，在所有细胞中，免疫荧光染色 MAP2阳性新生大鼠海马神经元细胞纯度达96.3%。结论通过上述改良方法培养获得的新生大鼠海马神经元细胞生长状态良好，并具有较高的纯度，可为进一步进行新生儿缺血性脑损伤模型等海马神经元相关疾病的研究提供实验条件。

关键词：海马神经元、原代培养、细胞、培养的、形态学特征、荧光免疫测定、缺血缺氧、脑、大鼠

分类号：R33;R59

资助基金：四川省科技厅科技支撑计划资助项目2014FZ0113

在线出版日期：2016-04-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：24-28