抗SSA噬菌体抗体库的构建及鉴定

摘要：

目的用噬菌体展示技术构建抗SSA单链抗体库.方法分离抗SSA抗体阳性病人外周血单个核细胞,提取RNA并反转录cDNA.扩增免疫球蛋白重链可变区(VH)和κ链可变区(Vκ).通过重叠聚合酶链反应(PCR)用连接片段将VH和Vκ体外连接成单链抗体(single-chain Fv,scFv)基因.而后用SfiⅠ和NotⅠ酶切并与噬菌粒pHEN2连接;将pHEN2-scFv电转至大肠杆菌TG1,建立抗SSA scFv cDNA库.随机挑选克隆用PCR扩增插入片段了解插入效率.用辅助噬菌体VCS-M13感染含pHEN2-scFv的TG1,产生scFv噬菌体抗体.用酶联免疫吸附(ELISA)检测构建的scFv噬菌体抗体库中有无抗SSA抗体存在.结果与VH和Vκ支架结构互补的引物可扩增出300～400 bp大小VH和Vκ片断;重叠PCR体外连接成约800 bp大小scFv基因(VH-linker-Vκ).将scFv基因克隆至pHEN2,电转TG1后计数克隆数为3.0×107 cfu.随机挑选12个克隆,其中11个克隆PCR扩增出插入片段,插入效率约为91%.用辅助噬菌体VCS-M13感染含pHEN2-scFv的TG1后,产生1.2×1014pfu/ml噬菌体抗体颗粒.抗SSA ELISA试剂盒检测其抗SSA活性,scFv噬菌体抗体的A值比相同稀释度的VCS-M13的A值高2.0～2.2倍.结论建立的抗SSA scFv噬菌体抗体库含有的独立克隆数为3.0×107 cfu,插入效率约91%,ELISA检测证实此抗体库中存在抗SSA抗体.可进一步进行亲和力筛选以得到单克隆抗SSA scFv抗体.

关键词：自身抗原、细菌噬菌体、抗体

所属期刊栏目：7

分类号：R392

资助基金：国家自然科学基金39970698;首都医学发展科研项目首都ZD199801

在线出版日期：2004-01-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：394-398