以CRSIPR/Cas9技术删除CTLA-4后CTL抗裸鼠结肠癌移植瘤的效果

摘要：

目的:探讨使用CRSIPR/Cas9技术删除CTL的免疫检查点CTLA-4后CTL的抗裸鼠结肠癌移植瘤的效果及其作用机制.方法:针对CTLA-4设计特异性小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)并构建sgRNA/Cas9质粒,使用慢病毒载体转染质粒至CTL获得删除CTLA-4的CTL(CTLA-4 KO CTL),并验证质粒的转染效率和CTLA-4的删除效率.BALB/c裸鼠随机分为2组进行实验,预防性注射CTLA-4 KO CTL(实验组)及CTL(对照组),3d后接种结肠癌细胞株LS 174-T,观察成瘤率及成瘤时间.建立结肠癌移植瘤裸鼠模型,成瘤后裸鼠随机分为2组,分别给予CTLA-4 KO CTL(实验组)及CTL(对照组)进行细胞治疗,观察移植瘤的体积、裸鼠的生存时间,并检测移植瘤裸鼠血清中TNF-α及IFN-γ分泌水平.结果:设计sgRNA并成功构建以慢病毒为载体的CRSIPR/Cas9系统,使用构建好的CRSIPR/Cas9系统转染CTL细胞,转染效率最高可达(28.80±0.62)％,转染后以流式细胞术检测CTLA-4的删除效率,CTLA-4 KO CTL组的CTLA-4表达较CTL组显著降低[(0.91±0.25)％ vs (42.70±2.72)％,P＜0.01].预防实验中,实验组结肠癌移植瘤发生率明显低于对照组(33.33％ vs 100.00％,P＜0.01).治疗实验中,实验组肿瘤体积较对照组显著减少[(503.0±23.9)vs(911.2±51.4)mm3,P＜0.05],实验组裸鼠相较于对照组生存时间明显延长(中位生存期:78 vs 42 d,P＜0.05),实验组裸鼠血清TNF-α[(268.93±1 7.04) vs (148.26±20.07) pg/ml,P＜0.05]及IFN-γ[(315.38±18.67)vs (202.92±29.32) pg/ml,P＜0.05]的分泌水平较对照组明显增高.结论:以CRSIPR/Cas9技术成功删除CTL中免疫检查点CTLA-4后可以显著抑制裸鼠结肠癌移植瘤的成瘤率、增强CTL对荷结肠癌裸鼠的抗肿瘤作用,并明显增高荷瘤鼠血清中TNF-α和IFN-γ水平.

关键词：CRSIPR/Cas9、CTLA-4、CTL、结肠癌移植瘤、免疫治疗

所属期刊栏目：27

分类号：R730.51;R735.3(肿瘤学)

资助基金：河北省医学科学研究重点课题计划资助项目No.20180375

在线出版日期：2020-06-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：221-227