Rho激酶抑制剂的高通量筛选模型建立与应用
目的 建立重组人Rho激酶(Rho-associated coiled-coil froming protein kinase,ROCK)的表达、纯化方法,并建立基于荧光素酶发光法的ROCK抑制剂的高通量筛选(high throughput screening,HTS)模型,通过大规模筛选发现其选择性抑制剂,为心脑血管、神经系统等疾病的预防和治疗提供新的治疗策略.方法 用分子生物学的技术,构建ROCK-1/pET32a表达质粒,转化入大肠杆菌BL21中,筛选阳性克隆,诱导目的 蛋白表达.纯化可溶性蛋白后,用Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay进行活性鉴定,用Z'因子评价HTS方法的稳定性,并对3万个化合物和中药提取物进行了HTS.结果 重组人ROCK-Ⅰ蛋白显示较好的激酶活性,建立的HTS模型Z'因子为0.75,基于此模型筛选出4个活性化舍物和5个活性提取物.结论 本实验建立了一个简单而快速的人重组ROCK-Ⅰ表达系统,该系统具有低成本、稳定、表达量大等特点.ROCK-Ⅰ的化学发光检测方法适用于HTS技术,具有较高的稳定性、灵敏性和可重复性.
Rho激酶、高通量筛选、表达、大肠杆菌、化学发光
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R965(药理学)
国家自然科学基金;卫生公益性行业科研专项
2010-06-29(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)
580-584