间充质干细胞小细胞外囊泡的分离纯化方法比较

摘要：

目的 探讨在间充质干细胞上清液中分离纯化小细胞外囊泡的优化方法.方法 对比差速离心[differential(ultra)centrifugation,dUC]、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀和QIAGEN试剂盒法3种标准细胞外囊泡分离程序,并基于标准程序分别进行超滤浓缩、0.22μm滤膜过滤或0.45 μm滤膜过滤改良方案提取小细胞外囊泡,通过比较各分离方法的操作时长和简易程度,并分别用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析技术(nanoparticle tracking analysis,NTA)和Western blot评估小细胞外囊泡的形态结构、粒径分布和标志蛋白表达情况,分析各分离方法提取的小细胞外囊泡质量和效率.采用CCK-8实验和Transwell迁移实验评估改良方法提取的小细胞外囊泡对乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响.结果 dUC法、PEG沉淀法和QIAGEN试剂盒法3种分离方法均可分离出小细胞外囊泡,其中QIAGEN试剂盒法操作时长最短,平均为48 min,添加超滤浓缩步骤后延长至93 min(P＜0.0001).PEG沉淀法的操作时间最长,平均为487 min,添加超滤浓缩步骤后延长至547 min(P＜0.0001).dUC法平均操作时间为217 min,添加超滤浓缩步骤后延长至274 min(P＜0.0001).各样本在透射电镜下均观察到典型的"茶托"样结构,粒径分布范围除QIAGEN试剂盒法在200 nm以上,其余均在30-200 nm之间,其中dUC+0.45 µm滤膜过滤组一个视野中观察到的小细胞外囊泡典型结构最多且最完整.Western blot检测结果显示各方法提取的样本中均有阳性标志蛋白CD9、CD63、TSG101表达,不表达阴性标志物calnexin,但0.22 μm滤膜过滤后,各方法的小细胞外囊泡标志蛋白条带均变浅.NTA结果显示,dUC+0.45 μm滤膜过滤的小细胞外囊泡占比最高,达94.86％.不同方法提取的样本的粒径分布图显示,dUC法标准流程和dUC+0.45μm滤膜过滤组的NTA结果显示为单峰,曲线流畅.取dUC+0.45 µm滤膜过滤的样本进行乳腺癌细胞表型实验,结果显示,细胞增殖和迁移能力均增强(均P＜0.05).结论 dUC法是一种有效的间充质干细胞小细胞外囊泡分离方法,在进行超速离心前对细胞上清液进行0.45μm滤膜过滤,可以提高小细胞外囊泡的质量.

关键词：肿瘤微环境、间充质干细胞、小细胞外囊泡、分离纯化

所属期刊栏目：16

分类号：R737.9(肿瘤学)

资助基金：广西自然科学基金区域高发疾病研究联合专项资助项目;国家自然科学基金

在线出版日期：2024-09-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：424-432