人端粒酶逆转录酶基因小片段干扰RNA慢病毒表达载体的构建及其在子宫颈癌caski细胞的表达

摘要：

目的 构建及鉴定携带沉默人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)慢病毒(lentivirus,LV)表达载体,并观察其在子宫颈癌caski细胞的表达情况.方法 以Designer3.0(Genepharma)软件设计靶向hTERT基因特异性的小片段RNA(shRNA)干扰序列,将hTERT-shRNA基因片段插入重组慢病毒pGLV3/H1/GFP+Pum,构建慢病毒表达质粒LV3-shRNA-hTERT,酶切、DNA测序验证hTERT片段准确性.LV3-shRNA-hTERT与包装质粒共转染293T细胞,浓缩上清液并测定病毒滴度获得重组慢病毒后感染caski细胞.将细胞分为空白对照组(未感染病毒的caski细胞)、阴性对照组(感染空载病毒LV3-shNC的caski细胞)和hTERT干扰组(感染携带LV3-shhTERT慢病毒的caski细胞).绿色荧光蛋白(GFP)的表达判断转染结果并估计转染效率,流式细胞术仪检测病毒感染率,实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测转染后基因hTERT mRNA的表达情况,CCK-8法检测caski细胞增殖情况.结果 将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功;成功包装成高滴度的慢病毒,且能有效感染子宫颈癌caski细胞.荧光定量PCR检测结果证实构建的hTERT-小片段干扰RNA慢病毒表达载体可显著抑制hTERT基因的表达.hTERT干扰组细胞增殖受抑制,生长速度较阴性对照组生长缓慢.结论 成功构建了携带hTERT-shRNA慢病毒表达载体LV3-shRNA-hTERT,并稳定转染子宫颈癌caski细胞.该载体能够有效抑制hTERT的表达,使子宫颈癌caski细胞增殖缓慢,为进一步探讨hTERT基因在子宫颈癌的发病机制和体外基因干预治疗奠定基础.

关键词：子宫颈肿瘤、人端粒酶逆转录酶基因、慢病毒载体、小片段RNA、caski细胞

所属期刊栏目：6

分类号：R737.33(肿瘤学)

资助基金：广西自然科学基金资助项目2013GXNSFAAO19254

在线出版日期：2015-03-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：342-347