miR-21真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖与凋亡的影响

摘要：

目的探讨人微小 RNA-21(miR-21)重组表达质粒对人胃癌 SGC-7901细胞增殖与凋亡的影响及可能机制.方法设计合成靶向 miR-21的互补双链 DNA,退火后与真核表达载体 pPG-miR-EGFP 克隆连接,构建 pPG-miR-21-EGFP 重组表达质粒,利用脂质体 LipofectamineTM2000将鉴定正确的重组表达质粒 pPG-miR-21-EGFP 转染人胃癌 SGC-7901细胞,荧光显微镜下观察转染效率.实验分为3组:空白对照组、空载体组、重组表达质粒组.以 RT-PCR 检测转染前后胃癌细胞 miR-21的表达水平.MTT 法评价重组表达质粒抑制肿瘤细胞生长的效果,流式细胞术及 Hoechst 33258法检测转染后胃癌 SGC-7901细胞周期的分布和凋亡.Western blot 法、免疫细胞化学法分别检测转染前后 PTEN、PCNA、PDCD4、bcl-2、cyclin D1蛋白表达的水平.结果酶切及测序鉴定证实成功构建重组质粒 pPG-miR-21-EGFP,转染人胃癌 SGC-7901细胞后,荧光显微镜下观察转染效率达75%.RT-PCR 检测显示重组表达质粒组胃癌细胞 miR-21的表达下调,与空白对照组和空载体组比较,差异具有统计学意义(P<0.05).Western blot 法、免疫细胞化学法检测结果显示重组表达质粒组胃癌细胞 cyclin D1、PCNA、bcl-2蛋白的表达下调(P<0.05),而 PDCD4、PTEN 蛋白的表达上调(P<0.05).重组表达质粒组的细胞生长缓慢,凋亡指数增加.流式细胞术检测结果显示重组表达质粒组 G1期细胞的百分比较空白对照组增加[(69.71±0.314)% vs(50.1±0.331)%],S 期细胞较空白对照组明显减少[(14.68±0.448)% vs(28.47±0.316)%](P<0.05).结论重组表达质粒 pPG-miR-21-EGFP 可显著下调 miR-21在胃癌 SGC-7901细胞中的表达,并在一定程度上抑制胃癌细胞的增殖,促进其凋亡,使较多的细胞停留在 G1期,S 期细胞减少,其作用机制可能是通过下调 cyclin D1、PCNA、bcl-2蛋白的表达,上调 PDCD4、PTEN 蛋白的表达而实现的.

关键词：胃肿瘤、微小RAN-21、增殖、凋亡

分类号：R735.2(肿瘤学)

在线出版日期：2013-05-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：6-11