人组织因子途径抑制因子在毕赤酵母中的表达与纯化
目的 利用毕赤酵母高效表达人组织因子途径抑制因子(TFPI).方法 利用基因定点突变技术对人TFPI cDNA特定序列进行定点突变(同义突变).将获得的突变体及野生型cDNA分别插入表达载体pPic9中,转化酵母宿主菌GS115和KM71,用0.5%的甲醇诱导重组蛋白表达.细胞培养上清经超滤浓缩后,依次用DEAE-sepharose Fast Flow、Heparin-sepharose CL6B及 Sephadex G-75柱层析分离纯化得到重组蛋白,分别采用凝胶扫描成像定量分析和底物显色法测定重组蛋白的表达量和活性.结果 凝胶扫描成像定量分析显示,同义突变体的表达量(1 mg/L)显著高于天然型(0.1 mg/L).活性测定表明GS115重组菌在诱导表达12 h后即可于培养上清中检测到TFPI活性,36 h达峰值;而KM71重组菌诱导表达24 h后才开始于培养上清中检测到TFPI活性,72 h达峰值.两个菌株中突变体mTFPI-pPic9转化子的表达量均显著高于TFPI-pPic9转化子.重组蛋白相对分子质量约为42 000.结论 对TFPI-cDNA特定序列进行同义突变后能显著提高重组蛋白在毕赤酵母细胞中的表达,且显著高于在酿酒酵母和昆虫细胞的表达;重组蛋白具有良好的生物活性.因此,利用毕赤酵母表达TFPI是一种较好的选择.
组织因子途径抑制因子、毕赤酵母、同义突变
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Q81(生物工程学(生物技术))
天津市应用基础重点基金033801611;天津市自然科学基金013803311
2007-06-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共6页
222-227
