人干细胞因子受体膜外区1～3免疫球蛋白样结构域的表达、纯化及活性

摘要：

目的在原核和真核细胞中表达人干细胞因子受体(c-Kit)配体结合区膜外N端1～3免疫球蛋白样结构域(c-Kit/Ig1～3),研究其配体结合活性.方法采用重叠延伸PCR定点诱变法合成c-Kit/Ig1～3双突变片段(c-Kit/Ig1～3DM),构建pET16b-c-Kit/Ig1～3DM表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,稀释复性,镍柱纯化.将C端添加组氨酸标签的c-Kit/Ig1～3基因克隆入真核表达载体pEAK12中,转染HEK293 ET细胞构建c-kit/Ig1～3高效表达细胞株,从细胞培养上清中使用镍金属螯合柱收集纯化蛋白.His-tag pull-down和酶联免疫结合实验检测融合蛋白配体结合活性.结果在大肠杆菌中c-Kit/Ig1～3DM以包涵体形式表达,复性后配体结合活性很低.在HEK293 ET细胞中筛选到2个高效表达c-Kit/Ig1～3的细胞株,上清表达量为2μg/ml,融合蛋白相对分子质量为58 000;受体配体结合实验显示真核表达的c-Kit/Ig1～3有明显的干细胞因子特异结合活性,解离常数Kd值为9.39 nmol/L.结论获得了具有较高配体结合活性的c-Kit/Ig1～3融合蛋白.

关键词：人干细胞因子受体、免疫球蛋白样结构域、his-tag pull-down、酶联免疫结合实验

所属期刊栏目：28

分类号：Q78(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家科技攻关项目2003AAZ3360

在线出版日期：2006-05-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：154-158