原癌基因Pokemon的克隆原核表达及纯化

摘要：

目的 克隆小鼠Pokemon(POK eryhroid myeloid ontogenic factor)基因并进行原核表达及重组蛋白的纯化.方法 应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆人pGEM-T-easy载体,经鉴定后,以限制性核酸内切酶分别消化重组质粒及原核表达载体pET-30a(+),体外定向连接,进行PCR、内切酶酶切及DNA序列分析,阳性重组表达质粒进一步转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达,经Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,Western blotting检测其特异性.结果 限制性核酸酶切及序列分析表明重组表达质粒包含Pokemon基因编码区,阅读框架无移位;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示有预期相对分子质量为36 000的重组蛋白表达,经亲和层析纯化后,融合蛋白的纯度达到90%以上;Western blotting印迹表明纯化的融合蛋白具有特异的免疫反应特性.结论 采用基因克隆技术成功构建了Pokemon原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,为后期抗体的制备及进一步研究该基因与肿瘤发生的关系奠定了基础.

关键词：原癌基因、遗传载体、原核表达

所属期刊栏目：6

分类号：R73(肿瘤学)

资助基金：山西省自然科学基金20021101

在线出版日期：2006-09-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：576-579