小亚璃眼蜱CPL截短基因的多克隆抗体制备及其应用研究

摘要：

组织蛋白酶L(CPL)是半胱氨酸蛋白水解酶,属于木瓜蛋白酶家族,参与蜱对血红蛋白降解与消化,是一种潜在的抗蜱疫苗候选抗原.为了制备小亚璃眼蜱(H.anatolicum)CPL多克隆抗体,并对其初步应用,本研究利用PCR方法扩增CPL截短基因(HanCPL)后构建pET-28a-HanCPL和pEGFP-C3-HanCPL质粒,pET-28a-HanCPL经IPTG诱导后通过SDS-PAGE检测重组HanCPL蛋白(rHanCPL)的表达,结果显示,正确构建了 pET-28a-HanCPL和pEGFP-C3-HanCPL质粒;rHanCPL以包涵体形式表达,分子量大小约为27 ku,可以被兔抗His tag抗体特异性识别;利用亲和层析柱和尿素透析法纯化rHanCPL后经western blot鉴定纯化效果,并测浓度后免疫新西兰兔,制备rHanCPL多克隆抗体,经western blot检测rHanCPL的反应性,采用间接ELISA测定多克隆抗体的效价.结果显示,rHanCPL纯化效果较好,浓度为3 mg/mL;rHanCPL可以与其多克隆抗体发生特异反应,且制备的rHanCPL多克隆抗体效价高达1∶204 800,可用于后续试验.利用制备的rHanCPL多克隆抗体作为一抗,通过免疫组化试验检测天然CPL在H.anatolicum中的定位,结果显示,天然CPL蛋白可以被rHanCPL多克隆抗体特异性识别,且其定位于H.anatolicum中的肠上皮细胞;另外将pEGFP-C3-HanCPL质粒转染至HEK-293T中,以制备的rHanCPL多克隆抗体作为一抗,使用western blot和IFA方法检测重组蛋白(EGFP-HanCPL)的表达及定位情况,结果显示EGFP-HanCPL蛋白也可与rHanCPL多克隆抗体特异性结合,其分子量约为46 ku,其主要定位于细胞质.本研究利用表达的rHanCPL制备了 rHanCPL多克隆抗体,并初步将该多克隆抗体用于CPL的相关研究,为后续抗蜱疫苗蛋白抗原的筛选提供参考依据.

关键词：小亚璃眼蜱、组织蛋白酶L、多克隆抗体、免疫组化

所属期刊栏目：44

分类号：S852.7(动物医学（兽医学）)

资助基金：新疆维吾尔自治区区域协同创新专项2021E01001

在线出版日期：2022-08-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：655-660