荧光重组酶聚合酶扩增/CRISPR-Cas12a快速检测恶性疟原虫方法的建立与初步评价
目的 建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和CRISPR-Cas12a系统的荧光快速检测恶性疟原虫方法,并对其检测效能进行初步评价.方法 选择恶性疟原虫18S核糖体RNA(rRNA)基因为靶序列,设计和合成3组RAA引物及CRISPR来源RNA(crRNA),选择最佳组合并优化反应条件,建立荧光RAA/CRISPR-Cas12a检测方法.构建包括靶标区的恶性疟原虫3D7株18S rRNA基因质粒,将质粒浓度分别稀释成1000、100、10、1拷贝数/μL进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测敏感度;分别以间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体基因组DNA为模板,进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测特异度.分别采用荧光RAA/CRISPR-Cas12a法和巢式PCR法对50份疟疾临床样本进行检测,比较两种方法检测一致性.体外培养恶性疟原虫3D7株,经培养后获得的培养物采用健康人O型红细胞悬液稀释成1000、500、200、50、10个/μL等不同虫密度血液样本,以荧光RAA/CRISPR-Cas12a法进行检测,评价检测效果.结果 选择Pf-F3/Pf-R3/crRNA2作为引物组合、2.5μL作为B buffer添加量、40 min作为RAA反应时间和37℃作为CRISPR-Cas12a反应温度建立荧光RAA/CRISPR-Cas12a法,其可检出浓度为1拷贝数/μL的含恶性疟原虫3D7株18S rRNA基因的质粒;该法检测恶性疟原虫可见荧光信号,但检测卵形疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫及阴性对照均无荧光信号,且与梅毒螺旋体、人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒等其他病原体亦无交叉反应.采用荧光RAA/CRISPR-Cas12a法和巢式PCR法分别检测50份疟疾临床样本,两种方法检测结果完全一致(kappa值=1.0,P<0.001).恶性疟原虫3D7株经6 d体外培养,获得10 mL培养物,采用荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测稀释后的临床样本,得到最低检测限为50个疟原虫/μL.结论 荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测恶性疟原虫快速、敏感、特异,有望用于恶性疟原虫快速检测和风险监测.
恶性疟原虫、重组酶聚合酶等温扩增、CRISPR-Cas12a、检测效能
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R382..31(医学寄生虫学)
广西自然科学基金重点项目;广西自然科学基金面上项目;广东省教育厅重点项目;广东省粤东食药资源功能物质与治未病研究重点实验室;广东省潮州市科技计划项目;广东省潮州市卫生健康局科研项目
2023-04-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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