尿液中外源日本血吸虫小分子DNA片段提取方法的建立与评价
目的 建立尿液中外源添加的日本血吸虫小分子DNA片段提取方法,评价不同方法处理尿液后的提取效果.方法 以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,通过PCR扩增靶序列上的81 bp小分子DNA片段,经测序鉴定后作为拟添加到尿液样本中的外源小分子DNA片段.以SjG28为靶基因设计引物及探针,建立实时荧光定量PCR(qPCR)方法;将外源小分子DNA片段以10为梯度倍比稀释后进行扩增,评价该方法的敏感性;以日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、巴贝虫、十二指肠钩口线虫、华支睾吸虫、卫氏并殖吸虫基因组DNA为模板进行检测,评价该方法的特异性.将外源小分子DNA片段添加至人工尿液及健康人尿液后,经调整pH值、离心、浓缩等处理后,采用QIAmp Viral RNA Mini Kit(Qiagen试剂盒)、BIOG游离DNA提取试剂盒(BIOG试剂盒)提取尿液中的外源小分子DNA片段,比较不同处理方式及提取方法的效果.结果 成功制备81 bp外源日本血吸虫小分子DNA片段,建立的qPCR法最低能检测到100拷贝/μL的81 bp外源日本血吸虫小分子DNA片段.以上述7种寄生虫DNA为模板进行检测,仅日本血吸虫基因组DNA模板有荧光信号值增长.调整人工尿液pH值为5、6、7、8,采用Qiagen试剂盒提取其中的外源日本血吸虫小分子DNA片段回收率分别(49.12±2.09)％、(84.52±4.96)％、(89.38±3.32)％和(87.82±3.90)％;采用BIOG试剂盒提取小分子DNA片段回收率分别为(2.30±0.07)％、(8.11±0.26)％、(13.35±0.61)％、(20.82±0.68)％,两种方法提取回收率差异均有统计学意义(t=38.702、26.955、39.042、29.571,P均<0.01).采用Qiagen试剂盒提取人工尿液,pH值为5时核酸回收率最低(P均<0.05);pH值为6、7、8时,核酸回收率差异均无统计学意义(P均>0.05).人工尿液[(64.30±1.00)％vs.(58.87±0.26)％;t=12.033,P<0.05)]、健康人尿液[(31165±1017)拷贝/μL vs.(28471±818)拷贝/μL;t=23.164,P<0.05]经离心后,外源小分子DNA片段回收效果均降低;使用10K离心浓缩管浓缩人工尿液、使用100K离心浓缩管浓缩健康人尿液均能有效提高Qiagen试剂盒回收效果(P均<0.01).结论 成功建立了尿液中外源日本血吸虫小分子DNA片段的提取方法,Qiagen试剂盒提取效果较好.将尿液样本pH值调整至6～8、使用100K离心浓缩管浓缩健康人尿液样本均可提高提取效果.
日本血吸虫、尿液、游离DNA、小分子DNA片段、实时荧光定量PCR
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R383..24(医学寄生虫学)
国家自然科学基金;江苏省国际科技合作项目
2023-04-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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