日本血吸虫高速泳动家族B1蛋白基因的克隆表达与功能分析

摘要：

目的：克隆、表达日本血吸虫高速泳动家族B1蛋白（SjHMGB1），并研究其功能特性。方法利用逆转录PCR （RT-PCR）技术从日本血吸虫成虫mRNA中反转录扩增出编码SjHMGB1的完整开放阅读框DNA片段，然后将其亚克隆至原核表达载体质粒pET28a（+）中，构建重组表达质粒SjHMGB1-pET28a。将重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21（DE3），含重组质粒的转化子细菌经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导以表达重组SjHMGB1蛋白。通过镍螯合琼脂糖亲和胶亲和层析法制备纯化的重组SjHMGB1蛋白。通过DNA迟滞实验和动物免疫鉴定重组SjHMGB1的DNA结合和免疫学特性。通过免疫印迹试验（Western blotting）和RT-PCR确定SjHMGB1分子在日本血吸虫不同发育阶段的表达情况。以重组SjH-MGB1为抗原免疫小鼠，3次免疫后每只小鼠感染45±2条血吸虫尾蚴，42 d后剖杀，计算减虫率与减卵率，观察其诱导抗血吸虫感染的免疫保护性作用。结果采用RT-PCR法从日本血吸虫成虫mRNA中反转录扩增到长度约为530 bp的特异性DNA条带，序列分析证实为编码SjHMGB1蛋白的开放阅读框序列。将此片段亚克隆至表达质粒pET28a（+）中，成功构建了重组表达质粒SjHMGB1-pET28a。含重组表达质粒SjHMGB1-pET28a的转化子细菌经IPTG诱导能表达分子量约28 kDa的可溶性SjHMGB1蛋白。采用镍螯合亲和层法制备了纯化的重组SjHMGB1蛋白。DNA迟滞试验显示纯化的Sj HMGB1蛋白可同超螺旋及线性DNA结合，重组SjHMGB1免疫小鼠能产生高效价的抗体IgG，Western blotting分析证实重组SjH-MGB1蛋白能被重感染小鼠血清所识别，表明重组表达的SjHMGB1分子具有天然蛋白的功能活性与免疫学特性。RT-PCR和Western blotting分析显示SjHMGB1分子在血吸虫成虫和虫卵期大量表达，而在尾蚴阶段表达量极低。免疫保护性试验结果表明，重组SjHMGB1分子免疫不能诱导有效的抗血吸虫感染免疫保护性作用。结论获得了编码SjHMGB1基因和纯化的具有天然功能活性的重组SjHMGB1蛋白；重组SjHMGB1蛋白具有强烈的免疫原性，但不能诱导有效的抗血吸虫感染免疫保护性作用。

关键词：日本血吸虫、高速泳动B1家族蛋白、基因克隆、基因表达、DNA结合活性、免疫原性、免疫保护作用

分类号：R383.24(医学寄生虫学)

资助基金：国家重大科技专项2012ZX10004220；国家自然科学基金81201316、30972581、30471515；江苏省自然科学基金BK2012544、BK2008110

在线出版日期：2014-05-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：153-159