利用CRISPR/Cas9技术构建PPARγ基因敲除的IPEC-J2细胞系

摘要：

[目的]利用CRISPR/Cas9技术敲除猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)的过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)基因,进而在细胞水平上研究PPARγ基因与肠道炎症反应相关的生物学机制.[方法]根据猪PPARγ基因序列(GenBank登录号:NM_214379),在第2外显子区域设计2对sgRNA序列,经退火形成DNA双链后连接至真核表达载体gRNA_GFP-T1;将构建成功的PPARγ正向打靶载体、反向打靶载体、Cas9-nickase质粒共转染至IPEC-J2细胞,经G418药物筛选获得单克隆细胞株,提取单克隆细胞株DNA后进行PCR扩增,经凝胶电泳鉴定后送测序;挑选基因敲除效果最佳的细胞株,利用免疫荧光法检测PPARγ蛋白表达情况.[结果]打靶载体测序结果显示,打靶序列正确连接;经转染、筛选后共获得48株单克隆细胞;测序结果显示,6株单克隆细胞出现双峰,分别为KO-15、KO-17、KO-21、KO-25、KO-32和KO-35;选择底峰较高的KO-25进行免疫荧光检测,结果显示PPARγ蛋白表达降低.[结论]本研究利用CRISPR/Cas9技术成功获得了 PPARγ基因敲除的IPEC-J2细胞,为后续进一步研究PPARγ基因在炎症反应中的功能奠定了基础.

关键词：CRISPR/Cas9、过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)、IPEC-J2细胞、基因敲除

所属期刊栏目：50

分类号：Q78(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金;国家自然科学基金;云南省自然科学基金;兴滇英才支持计划项目

在线出版日期：2023-08-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：2670-2677