奶牛CRY1基因真核表达载体构建、生物信息学分析及组织表达谱研究

摘要：

[目的]扩增奶牛隐花色素昼夜节律调节因子1(cryptochrome circadian regulator 1,CRY1)基因全长编码区(coding sequence,CDS),构建该基因的真核表达载体并对其进行生物信息学分析,检测奶牛CRY1基因的表达谱,为后续探究CRY1蛋白的生物学功能提供参考.[方法]以奶牛肝脏组织cDNA为模板,PCR扩增CRY1基因CDS区,将其与酶切线性化的pcDNA3.1-3HA空质粒以同源重组法连接,重组质粒命名为pcDNA3.1-3HA-cCRY1;利用在线软件对奶牛CRY1基因进行生物信息学分析.将空质粒pcDNA3.1-3HA和重组质粒pcDNA3.1-3HA-cCRY1转染至HEK293T细胞,利用Western blotting技术检测奶牛CRY1基因在蛋白水平的表达;利用实时荧光定量PCR检测CRY1基因在奶牛不同组织中的表达量.[结果]试验成功获得1 764 bp的奶牛CRY1基因CDS区序列,且成功构建pcDNA3.1-3HA-cCRY1真核表达载体.奶牛CRY1基因与牦牛、山羊、绵羊相似性在98％以上,且遗传距离较近.生物信息学分析表明,CRY1蛋白为碱性、亲水性蛋白,无跨膜结构与信号肽,存在45个潜在磷酸化位点,与CLOCK、ARNTL、FBXL3等多个蛋白存在互作.Western blotting结果表明,pcDNA3.1-3HA-cCRY1转染组在72 ku处出现明显的条带,而pcDNA3.1-3HA转染组在相应位置处无条带.实时荧光定量PCR结果表明,CRY1基因在奶牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏等10个组织中均有表达,其中在心脏中的表达量最高,在颈斜方肌中的表达量最低.[结论]本研究成功构建了 CRY1基因的真核表达载体,且在HEK293T细胞中实现了CRY1蛋白的过表达.CRY1蛋白是一种不稳定的胞内蛋白,可与多种蛋白互作,并参与昼夜节律调控、细胞代谢、糖异生等过程.CRY1基因在牛、羊等反刍动物间较为保守,在奶牛多种组织中均有表达.研究结果为深入探究CRY1蛋白在奶牛生物钟系统中的转录调控机制提供参考依据.

关键词：奶牛、CRY1基因、生物信息学、组织表达谱

所属期刊栏目：50

分类号：Q78(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金;中国博士后科学基金

在线出版日期：2023-05-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共12页

页码：870-881