鸡RNF165蛋白多克隆抗体制备及其生物信息学分析

摘要：

[目的]制备鸡环指蛋白165(RNF165)多克隆抗体并对RNF165蛋白进行生物信息学分析,以期为研究鸡RNF165的生物学功能提供参考.[方法]以鸡胚成纤维细胞(DF-1)为试验材料,提取总RNA,反转录获得cDNA,通过PCR扩增RNF165基因,将其连接至pET-28a(+)质粒构建重组表达质粒pET-28a-RNF165.将测序正确的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达,将表达的融合蛋白纯化后按照制定的免疫程序免疫7周龄BALB/c雌鼠.第3次免疫7 d后,分离小鼠血清,用Western blotting检测鼠抗RNF165蛋白多克隆抗体的特异性,间接ELISA法测定其效价.使用在线生物信息学软件对RNF165蛋白理化性质、信号肽、磷酸化位点、亚细胞定位、跨膜结构、二级结构和保守结构域进行分析.[结果]成功扩增得到大小为1 068 bp的RNF165基因.成功构建原核表达载体pET-28a-RNF165,并诱导表达出约43 ku的RNF165蛋白.Western blotting结果显示,制备的鼠抗RNF165蛋白多克隆抗体能特异性识别DF-1细胞中过表达的RNF165蛋白,效价为1∶32 000.生物信息学分析结果显示,RNF165蛋白由350个氨基酸组成,分子质量为39.88 ku,等电点为7.13,不稳定指数为69.87,为亲水性蛋白,不含信号肽和跨膜结构域,有29个磷酸化位点;RNF165蛋白二级结构主要由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成;RNF165出现在细胞核内的概率最高,为47.8％;RNF165蛋白质C-端296-341位氨基酸残基为RING-Ubox超家族保守结构域.[结论]本研究所制备的鼠抗RNF165多抗隆抗体具有较高的反应性和特异性,RNF165蛋白为亲水性蛋白,主要在细胞核内表达,结果可为研究RNF165蛋白的生物学功能提供材料支持.

关键词：环指蛋白165(RNF165)、多克隆抗体、生物信息学分析

所属期刊栏目：49

分类号：Q78(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金31972646

在线出版日期：2023-01-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：4159-4167