猪丁型冠状病毒N蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

摘要：

[目的]表达与纯化猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)的核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白,并制备其多克隆抗体(polyclonal antibody,Pc Ab).[方法]以PDCoV CHN-HN-1601分离株基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增PDCoV全长的N基因编码序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒pET-28a-PDCoV-N.经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导表达12 h.在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化N-端和C-端均携带6 X His标签的重组N蛋白,并将其免疫新西兰白兔制备抗血清.利用Protein A/G琼脂糖树脂从免疫兔的抗血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定及抗体效价的间接ELISA测定.[结果]重组PDCoV-N蛋白以可溶性和包涵体两种形式表达,分子质量约为42 ku;上清可溶性N蛋白的纯化纯度可达90％、蛋白浓度为0.45 mg/mL;纯化后的多克隆抗体纯度较高,ELISA方法检测其效价为1 ∶ 6 400,能特异性地识别重组N蛋白和PDCoV,与可引起猪腹泻的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRoV)无交叉反应.[结论]本研究成功制备重组PDCoV-N蛋白及其多克隆抗体,为后续深入研究N蛋白的功能、PDCoV优化血清学检测方法、免疫层析试纸条的制备及开展PDCoV相关基础研究提供参考.

关键词：猪丁型冠状病毒(PDCoV)、核衣壳(N)蛋白、原核表达、多克隆抗体(PcAb)

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分类号：S852.65+1(动物医学（兽医学）)

资助基金：现代农业产业技术体系CARS-35

在线出版日期：2022-08-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：2698-2707