基于非洲猪瘟病毒截短p72蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

摘要：

[目的]建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)ELISA抗体检测方法.[方法]以重组截短p72(p72s)蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件;应用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线阈值评价标准,确定方法的阴阳性临界值;检测方法的特异性、敏感性、批内与批间重复性;最后分别用建立的ELISA方法和商品试剂盒检测124份血清,比较两者的阳性检出率,并通过Western blotting验证ELISA的检测结果.[结果]ELISA方法的抗原最佳包被浓度为0.5 μg/mL,待检血清与酶标抗体的最适稀释度分别为1 ∶ 100和1 ∶ 5 000;反应条件为:抗原于37℃孵育1 h后经4℃包被酶标板过夜、于37℃封闭1 h或室温封闭2 h、待检血清和酶标抗体分别于37℃反应60和45 min及加入底物后于室温避光显色20 min;阴阳性血清的判定标准为:当待检血清的D450 nm值≥0.365时,判定为阳性;当D450 nm值＜0.36 5时,判定为阴性.该方法只与ASFV阳性血清发生特异性结合,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒抗血清均无交叉反应;能检测到ASFV抗血清中的总蛋白量为0.091～0.153 mg/mL,低于商品试剂盒的最低检测量(0.110～0.554 mg/mL);批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.70％与5.125％.对临床血清样本检测时,建立方法和商品试剂盒的阳性检出率分别为75.81％(94/124)和32.26％(40/124).进一步验证表明,Western blotting与ELISA的检测结果完全一致.[结论]建立了基于ASFV-p72s蛋白的ELISA抗体检测方法,该方法特异、敏感和重复性稳定,能够用于ASF临床诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力.

关键词：非洲猪瘟病毒(ASFV)、截短p72蛋白、原核表达、间接ELISA

所属期刊栏目：49

分类号：S855.3(动物医学（兽医学）)

资助基金：河北省重点研发计划项目;河北省高等学校科学技术研究青年项目

在线出版日期：2022-08-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：2688-2697