绵羊肺炎支原体P6058aa-928aa蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

摘要：

[目的]建立基于绵羊肺炎支原体表面脂蛋白P60的间接ELISA方法.[方法]利用生物信息学软件对P60蛋白进行抗原性分析,筛选出抗原性最佳的区域,扩增目的基因后构建重组表达载体并进行基因测序,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导抗原性最佳蛋白表达并进行诱导时间优化;利用SDS-PAGE分析该蛋白分子质量大小及其表达形式.以重组蛋白作为抗原,绵羊肺炎支原体阳性血清作为抗体,通过Western blotting方法分析其反应原性.以重组蛋白为包被抗原,建立抗原性最佳蛋白的间接ELISA抗体检测方法,用该方法对20份阴性血清进行检测,计算阴阳临界值;检测该方法的特异性、敏感性和重复性,并用建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份绵羊临床血清样本进行检测.[结果]经DNAStar分析,P60蛋白第58-928位氨基酸区域的平均抗原指数在0.8～1.7之间,亲水指数为0～2.0,证明该区域(P6058aa-928aa)抗原性和亲水性较强;通过PCR扩增得到P6058aa-928aa基因,并构建重组表达载体,通过基因测序证明该重组表达载体与预期结果一致.SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导浓度为1 mmol/L,诱导10 h时蛋白表达量较高,蛋白分子质量为42 ku,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达;Western blotting结果表明,构建的重组蛋白具有良好的反应原性.对ELISA各条件进行优化结果显示:抗原包被浓度为0.5 μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶ 100,最佳孵育时间为1.5 h,酶标二抗最佳稀释倍数为1 ∶ 4 000,判定阴阳性血清的临界值为0.36.对口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、布氏杆菌(Brucella)、牛支原体(Mb)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)的标准阳性血清的检测均为阴性,证明该方法特异性较强;敏感性试验结果表明,血清稀释度为1:2 048时仍为阳性;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均＜10％,证明该方法具有较好的重复性.利用所建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份羊血清检测结果表明,二者的阳性符合率为81.6％,阴性符合率为92.6％,总符合率为88.0％.[结论]本研究建立的间接ELISA方法可用于临床样本的检测,为绵羊肺炎支原体的疫苗免疫效果评价和疾病诊断提供了较为可靠的方法.

关键词：绵羊肺炎支原体、P6058aa-928aa蛋白、原核表达、间接ELISA

所属期刊栏目：49

分类号：S852.5+3(动物医学（兽医学）)

资助基金：内蒙古农业大学科技成果转化专项YZGC2017027

在线出版日期：2022-07-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：1960-1969