CRISPR/Cas13d介导猪胎儿成纤维细胞SUV39 H1/SUV39 H2基因敲降

摘要：

研究旨在利用CRISPR/Cas13d系统对猪胎儿成纤维细胞(PEF)中的胚胎发育相关基因SUV39 H1/SUV39 H2进行RNA水平的敲降,从而在猪上建立CRISPR/Cas13d介导的基因敲降系统.根据SUV39 H1、SUV39 H2基因的编码序列各设计3个靶向编码链的sgRNAs,并以单链寡核苷酸的形式合成,退火后与BspQⅠ线性化的sgRNA表达载体进行连接,构建SUV39H1-sgRNA和SUV39H2-sgRNA表达载体,用Sanger软件进行测序;将Cas13d表达载体和靶向SUV39 H1/SUV39 H2基因的sgRNA载体按照1∶1、1∶2、1∶4、2∶1和4∶1比例转染猪胎儿成纤维细胞,48 h后收集细胞,用流式细胞术分选检测细胞转染效率,用半定量PCR和实时荧光定量PCR检测敲降效率;用半定量PCR和免疫荧光检测敲降SUV39 H1/SUV39 H2基因后,靶基因转录水平及组蛋白H3K9me3水平的变化.测序结果表明,针对2个基因设计的各3条sgRNAs均成功连入载体中;流式细胞术分选结果显示,转染效率约70％;半定量PCR结果表明,与对照组相比,3个sgRNAs均极显著降低了SUV39 H1和SUV39 H2基因的表达(P＜0.01),其中SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1均可使SUV39H1和SUV39H2的表达降低50％;Cas13d∶sgRNA为1∶1、1∶2和1∶4组细胞的存活率高于2∶1和4∶1组;实时荧光定量PCR结果表明,Cas13d∶sgRNA为1∶2、1∶4、2∶1和4∶1组敲降效率均显著高于1∶1组(P＜0.05),且Cas13d∶sgRNA为1∶2组敲降效率最高(70％).半定量PCR结果显示,转染SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1极显著降低SUV39H1和SUV39H2的表达,表达量为对照组的25％～30％ (P＜0.01).免疫荧光检测结果表明,敲降SUV39 H1和SUV39 H2基因后,组蛋白H3K9me3水平显著降低(P＜0.05).因此,本研究利用CRISPR/Cas13d系统在猪胎儿成纤维细胞中成功敲降SUV39H1和SUV39H2,并下调其催化的H3K9me3水平.

关键词：CRISPR/Cas13d、SUV39 H1/SUV39 H2基因、敲降、猪胎儿成纤维细胞

所属期刊栏目：48

分类号：Q786(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金;国家自然科学基金

在线出版日期：2021-08-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：1957-1966