马疱疹病毒1型QuantStudioTM3D数字PCR检测方法的建立

摘要：

试验旨在建立一种高灵敏性的马疱疹病毒1 (EHV-1) 3D数字PCR(3D-dPCR)检测方法,对EHV-1病毒含量较低的样品能准确定量检出,实现马鼻肺炎早期诊断及预防.根据EHV-1糖蛋白B基因保守区域设计特异性引物和探针,优化3D-dPCR反应体系中引物探针浓度和退火温度,对该方法进行灵敏性、特异性、重复性分析,建立了EHV-1的3D-dPCR方法.本研究建立的3D dPCR方法,引物和探针最佳浓度分别为0.4和0.4μmol/L,最佳退火温度为60℃,该方法绝对定量曲线的R2=0.998,线性关系良好,与实时荧光定量PCR方法相比灵敏度高10倍左右,最低检出限为5.83拷贝/μL;批内和批间重复性试验变异系数均＜3.2％;与EHV-4、马泰勒虫、马病毒性动脉炎的核酸无交叉反应;通过对123份临床样品进行3D-dPCR检测,结果显示,3D-dPCR方法阳性检出率为66.7％,高于世界动物卫生组织(OIE)中EHV-1的实时荧光定量PCR方法阳性检出率64.2％.3D-dPCR方法对病毒含量较高的样品与实时荧光定量PCR结果一致,对病毒含量较低的样品敏感性更高,能有效检出可疑样品.本试验结果表明,建立的3D-dPCR方法检测低拷贝数的临床样品时灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于EHV-1的准确定量检测.

关键词：马疱疹病毒1型(EHV-1)、3D数字PCR(3D-dPCR)、绝对定量

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分类号：S852.65(动物医学（兽医学）)

资助基金：2018海关总署科研计划项目;2019海关总署科研计划项目

在线出版日期：2020-06-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：1299-1306