噬菌体裂解酶Lysep3的毕赤酵母重组表达和活性分析

摘要：

试验以突破噬菌体裂解酶Lysep3应用瓶颈为切入点,采用酵母表达系统对其进行重组表达以期降低生产成本,同时初步探究其体外抗菌活性和安全性,以期为临床试验提供数据参考.根据毕赤酵母密码子偏爱性优化并合成Lysep3基因,将其连接至表达载体pPICZ αA.经菌落PCR和测序验证后,将线性化重组载体pPICZαA-Lysep3电转化巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris X-33.重组酵母转化子经菌落PCR和摇瓶水平甲醇诱导重组蛋白初筛后,在5L发酵罐中高密度发酵,发酵上清液经His-trap HPGE纯化柱纯化.通过抑菌试验和浊度试验进行rLysep3的抑菌活性分析,通过测定rLysep3对巨噬细胞RAW264.7细胞毒性和小鼠血红细胞溶血性进行rLysep3的安全性分析.结果 显示,重组菌在5L发酵罐中甲醇诱导120 h后Lysep3的表达量达749.2 mg/L.抑菌活性分析发现,rLysep3对肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪葡萄球菌及无乳链球菌均具有抑菌活性,且rLysep3可与EDTA联合作用使肠炎沙门氏菌菌落数下降1.6～1.7个数量级.此外,细胞毒性试验发现,rLysep3在1 024 μg/mL浓度下细胞存活率仍可达78.75％;溶血性分析显示,1 024 μg/mL浓度下溶血率仅为1.58％.上述结果证明,通过毕赤酵母表达系统实现了Lysep3的重组表达,rLysep3具有体外抑菌活性,且具低细胞毒性和低溶血性.从抗菌活性、产业化制备及安全性等方面初步显示出rLysep3具有开发为临床治疗禽肠炎沙门氏菌感染的新型抗菌药物的潜力.

关键词：噬菌体裂解酶Lysep3、毕赤酵母、重组表达、肠炎沙门氏菌、抗菌活性

所属期刊栏目：47

分类号：S859.79+7(动物医学（兽医学）)

资助基金：中国农业科学院重大产出科研选题“饲用抗生素替代关键产品创制与产业化”;中国农业科学院科技创新工程“抗菌肽及抗生素替代品方向”

在线出版日期：2020-05-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：1018-1027