羊种布鲁氏菌wzt基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

摘要：

为建立检测血清中布鲁氏菌抗体的间接ELISA方法,本试验采用PCR技术从羊种布鲁氏菌QY1菌株中扩增得到wzt基因片段,连接到pET-30a载体上,构建质粒pET-30a-wzt,将鉴定正确的质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经原核表达系统对其进行表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析后,用亲和层析镍柱纯化wzt重组蛋白备用.以wzt重组蛋白为检测抗原,逐步优化条件后建立布鲁氏菌间接ELISA检测方法.结果 显示,试验成功构建了pET-30a-wzt原核表达载体,并在BL21 (DE3)宿主菌中表达;SDS-PAGE和Western blotting结果表明,重组蛋白约为35 ku,表达形式为上清,条带单一、无杂带,有很好的反应原性和特异性.ELISA优化试验确定了最佳包被浓度为15 μg/mL,血清最佳稀释度为1∶80,酶标抗体的最佳稀释度为1∶5 000;通过检测24份阴性样品确定临界值,当样品D450nm值≥0.30为阳性,样品D450nm值＜0.30时为阴性;特异性试验表明,该方法不与小肠耶尔森菌、大肠杆菌发生交叉反应;批内及批间变异系数均＜10％;用该方法对120份血清样本进行检测,并与虎红凝集试验进行相符性验证,符合率为96％.本试验建立的间接ELISA方法为布鲁氏菌病的检测提供了可靠的技术手段.

关键词：布鲁氏菌、wzt基因、原核表达、间接ELISA

所属期刊栏目：46

分类号：S852.61+4(动物医学（兽医学）)

资助基金：“十三五”国家重点研发计划项目2018YFD0500905

在线出版日期：2020-01-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：3707-3714