水牛miR-302s真核表达载体的构建及生物信息学分析

摘要：

试验旨在克隆并构建水牛miR-302s慢病毒真核表达载体(bbu-miR-302s),对其进行生物信息学分析,并尝试将该载体应用于水牛体细胞重编程中.以水牛基因组DNA为模板扩增得到bbu-miR-302s前体序列,测序正确后将其连入pLVX-IRES-ZsGreen1构建重组慢病毒真核表达载体.重组的慢病毒真核表达载体经过酶切鉴定正确后,采用脂质体转染方法包装慢病毒颗粒,通过感染HEK-293T细胞及猪和水牛体细胞,检测重组慢病毒载体的有效性.bbu-miR-302s有效感染水牛胎儿成纤维细胞(BFF)后,经诱导培养,检测能否产生水牛诱导多能干细胞(iPSC).采用CoGeM iR数据库查询法和SnapGene Viewer软件进行miR-302s家族在基因组中的定位分析;利用ClustalX 1.83软件分析miR-302s序列保守性;利用TargetScan和miRWalk软件预测bbu-miR-302s主要的靶基因,并运用DAVID程序对靶基因进行信号通路富集.测序结果显示,扩增获得的序列是水牛miR-302s家族,包装的重组慢病毒滴度为7.2×106 T U/mL,并可以有效感染3个物种的体细胞.bbu-miR-302s病毒感染BFF后,细胞经历形态变化并发生聚集形成克隆样,碱性磷酸酶检测阳性,但多能基因及表面抗原检测结果均为阴性,说明单因子miR-302s不足以完全重编程BFF为水牛iPSC,但促进了重编程进程.CoGeMiR数据库检索发现,miR-302s家族主要位于LARP7基因的内含子区;SnapGene Viewer软件进一步分析发现,bbu-miR-302s位于水牛7号染色体LARP7基因的内含子区.序列同源性分析表明,miR-302s家族成员间及miR-302s簇成员在不同物种间均高度保守.水牛miR-302s主要靶基因共255个,这些靶基因主要集中在33个信号通路中,其中PGK信号通路与胰高血糖素信号转导及调控干细胞信号通路最为显著.本研究结果为后续开展miR-302s簇在体细胞重编程中的作用奠定基础.

关键词：bbu-miR-302s、慢病毒真核载体、生物信息学分析

所属期刊栏目：46

分类号：Q78(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金31560632;广西自然科学基金2016GXNSFDA380030

在线出版日期：2019-10-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：2497-2506