羊口疮病毒ORF129基因的原核表达、纯化及鉴定

摘要：

试验旨在克隆羊口疮病毒ORF129基因,并对其编码蛋白进行表达及纯化.参照GenBank已发表羊口疮病毒OV-IA82株OORF129基因序列(登录号:AY386263.1),用Primer Premier 5.0软件设计合成1对特异性引物,利用PCR方法扩增ORF129全基因序列,将其与质粒pET 28a(+)经BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切后连接,构建重组质粒pET-28a(+)-ORF129.重组质粒经双酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌Rosttta感受态细胞,利用IPTG诱导ORF129基因的表达,经SDS-PAGE分析后,将表达产物超声破碎、洗涤、溶解,然后采用尿素梯度透析方法进行复性,经亲和层析法纯化日的蛋白并通过Western blotting对其进行鉴定.双酶切鉴定和测序结果表明,本试验成功构建了重组质粒,读码框正确,菌液起始D600nm值为0.4～0.8,37℃、220 r/min、1 mmol/LIPTG诱导3h时能得到ORF129包涵体蛋白,蛋白大小为58 ku,在加入精氨酸、甘油的复性液中,蛋白复性率较高,将复性后蛋白与Ni柱结合,在咪唑浓度为500 mmol/L时,能将蛋白洗脱,纯化的蛋白经Western blotting鉴定正确,证明蛋白成功表达.本研究成功构建了羊口疮病毒ORF129基因原核表达重组质粒,并成功表达和纯化了ORF129蛋白,为后续羊口疮病毒检测方法的建立奠定基础.

关键词：羊口疮病毒、ORF129基因、原核表达

所属期刊栏目：45

分类号：S852.65(动物医学（兽医学）)

资助基金：国家重点研发计划课题2017YFD0500903;国家现代肉羊产业技术体系项目CARS-39-04B

在线出版日期：2018-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：1798-1803