马立克氏病病毒meq基因缺失株细菌人工染色体序列自我敲除的分子鉴定

摘要：

本试验旨在对缺失meq基因的马立克氏病病毒(MDV)感染性克隆基因组中细菌人工染色体(BAC)序列的自我敲除进行分子鉴定.将含有表达cre重组酶真核表达盒的SC9-1重组质粒通过转染鸡胚成纤维细胞(CEF)拯救SC9-1重组病毒.将SC9-1重组病毒在CEF细胞上进行连续传代培养,利用病毒表达的cre重组酶在传代过程中逐步敲除病毒的BAC序列.分别提取1～10代不同代次SC9 1重组病毒的DNA作为模板,利用BAC序列特异性引物对病毒基因组中的BAC进行PCR检测.利用针对BAC序列gpt基因的特异性检测引物,以MDV保守基因pp38作为内参,对不同代次病毒基因组中BAC序列进行荧光定量PCR的检测.利用PCR扩增SC9-1病毒敲除BAC序列后基因组中残留loxp位点两端序列,通过测序分析进一步验证BAC序列的敲除.利用BAC序列特异性引物对不同代次病毒基因组中BAC序列的检测结果显示,1～5代病毒DNA均能扩增出600 bp的特异性目的条带,证实病毒的基因组中含有BAC序列.6～10代病毒DNA均不能扩增出特异性目的条带,证实病毒基因组中没有BAC序列.荧光定量PCR结果显示,病毒基因组中的BAC序列随着病毒的传代逐渐减少,直至第6代已经完全检测不到BAC序列.在病毒BAC序列敲除的过程中,对每代病毒BAC序列敲除后残留loxp位点序列进行PCR测序鉴定,结果显示BAC序列敲除后基因组中仅留下一个loxp位点,序列同源性均在99.7％以上.结果表明,利用cre/loxp系统将病毒在CEF细胞上连续6代传代培养可将MDV meq基因缺失株SC9 1的BAC序列完全敲除掉,且同源重组酶敲除BAC序列具有高度一致性.

关键词：马立克氏病、meq基因、细菌人工染色体、敲除、鉴定

所属期刊栏目：42

分类号：S852.65(动物医学（兽医学）)

资助基金：国家自然科学基金31072149

在线出版日期：2016-05-06（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：285-291