珍珠鸡MHC Ⅰ轻链基因的克隆、可溶性表达与纯化

摘要：

为了构建珍珠鸡MHC Ⅰ轻链β2m成熟肽基因的原核表达载体并在大肠杆菌中实现可溶性的表达,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法从鸡脾脏中提取总RNA,以总RNA为模板,5'-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3'为反转录引物,采用TaKaRa AMV反转录酶合成First-strand cDNA(fcDNA).根据GenBank中登录的鸡的β2m基因序列,设计了分别含EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的一对引物,分别扩增鸡β2m的成熟肽基因.PCR产物经纯化回收后,插入到含LacZ基因的原核克隆载体pGEM-T Easy中,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞,经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆.再把所克隆的片断亚克隆到表达载体pMAL-p2X,构建重组表达质粒p2X-β2m.将重组表达质粒转化人大肠杆菌E.coliTB1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析.结果表明,本研究克隆了鸡β2m成熟肽基因序列,全长约297bp,编码约98个氨基酸,并可溶性表达了鸡β2m成熟肽蛋白质分子.采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了Western blot鉴定.本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外共同构建MHC Ⅰ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础.

关键词：珍珠鸡、轻链、RT-PCR、可溶性表达、纯化

所属期刊栏目：33

分类号：Q75(分子遗传学)

资助基金：国家自然科学基金30371098

在线出版日期：2006-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：47-50