Akt1基因转染对BMSCs缺氧耐受影响的实验研究

摘要：

目的 探讨重组慢病毒(lentivirus,LVs)介导Akt1基因转染大鼠BMSCs能否提高细胞缺氧耐受能力,为提高干细胞移植治疗心肌梗死效果提供理论依据.方法 以LVs作为转染载体,增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为标记,构建携带Akt1基因的pLVX-EGFP-3FLAG病毒载体.取第3代3～5周龄SD大鼠BMSCs分别转染pLVX-EGFP空白病毒液(B组)和pLVX-EGFP-3FLAG病毒液(C组),以未转染病毒的BMSCs为空白对照组(A组).转染后2～3d荧光显微镜观察细胞绿色荧光表达情况,并于48h时采用Western blot法检测B、C组Akt1蛋白表达情况.将B、C组培养的BMSCs分别置于94％N2、1％O2和5％CO2缺氧箱进行缺氧干预(分别为B1、C1组),取B1、C1组缺氧干预0、3、6、9、12h的细胞以膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶双染法行流式细胞仪分析细胞凋亡率和死亡率、MTT法分析细胞增殖情况、Western blot法检测凋亡相关基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达情况.结果 转染后A组荧光显微镜下未见绿色荧光表达,B、C组可见明显绿色荧光,转染效率约60％;Western blot可检测到B、C组Akt1表达,且C组Akt1表达明显高于B组(t=17.525,P=0.013).B1组缺氧干预后各时间点细胞凋亡率和死亡率均逐渐增高,差异有统计学意义(P＜0.05);C1组细胞凋亡率和死亡率在缺氧干预后3h短暂下降,之后逐渐增高,差异有统计学意义(P＜0.05).除0h外,缺氧干预各时间点C1组细胞凋亡率和死亡率均显著低于B1组,差异有统计学意义(P＜0.05).MTT法检测示,常氧条件下B、C组各时间点吸光度(A)值均显著高于缺氧条件下B1、C1组(P＜0.05),C组各时间点A值均显著高于B组(P＜0.05),缺氧干预后6、9、12 h B1组A值显著低于C1组(P＜0.05).Western blot法检测示,与B1组比较,C1组缺氧干预各时间点Caspase-3表达均显著下调(P＜0.05).结论 通过重组LVs介导Akt1基因转染可通过抑制凋亡显著提高BMSCs的缺氧耐受能力,从而为改善干细胞移植治疗心肌梗死效果提供新思路.

关键词：Akt1、BMSCs、重组慢病毒、凋亡、缺氧、大鼠

所属期刊栏目：30

分类号：R735.7;R394.8;R651.2

在线出版日期：2016-05-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：479-484