慢病毒载体介导VEGF165基因修饰大鼠毛囊干细胞的实验研究
目的 为获得持续高表达VEGF165的大鼠毛囊干细胞(rat hair follicle stem cells,rHFSCs),观察慢病毒载体介导VEGF165基因对rHFSCs的转染及其表达情况.方法 切取1周龄SD大鼠触须部皮肤,Dispase酶和Ⅳ型胶原酶混合消化,显微镜下分离毛囊隆突部,组织块培养rHFSCs;经Ⅳ型胶原差速贴壁纯化后,分别取不同代次rHFSCs绘制细胞生长曲线;联合应用免疫荧光染色及实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-qPCR)检测相关基因鉴定细胞.钙转法包装pLV-内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)-VEGF165-增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreen fluorescent protein,EGFP)(实验组)和pLV-IRES-EGFP空载体(对照组)慢病毒,用两组慢病毒转染rHFSCs.倒置荧光显微镜下观察实验组绿色荧光表达情况,RT-PCR和Western blot法分别检测VEGF165 mRNA和蛋白表达情况. 结果 分离、培养、纯化的rHFSCs呈典型“铺路石”状,贴壁较牢,克隆形成能力强;纯化后细胞培养1～2 d处于生长潜伏期,5～6 d处于对数生长期;细胞免疫荧光染色可见毛囊干细胞标志物角蛋白15 (cytokeratin 15,CK15)、整合素α6和整合素β1表达呈阳性;RT-qPCR检测可见干细胞标志物CK15、CK19、整合素α1和整合素β1表达量高,而表皮干细胞标志物CD34和角质形成细胞标志物CK10表达量均较低.倒置荧光显微镜观察示,实验组慢病毒介导VEGF165基因转染14d后转染效率可达85.76％±1.91％; RT-PCR和Western blot检测示,实验组VEGF165 mRNA和蛋白表达均呈阳性,对照组均呈阴性. 结论 经显微镜联合组织块分离培养、Ⅳ型胶原差速贴壁筛选后,可得到高纯度rHFSCs,细胞增殖能力强.慢病毒介导的VEGF165基因修饰方法可成功转染并得到高表达VEGF165 mRNA和蛋白的rHFSCs,可为组织工程构建人工毛囊、血管及皮肤等提供良好的种子细胞.
皮肤组织工程、毛囊干细胞、VEGF165、慢病毒、基因修饰、大鼠
28
Social Development Project of Public Welfare Application Research of Zhejiang Technology Department2010C330133;浙江省科技厅公益技术应用研究社会发展项目2010C330133
2014-03-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共7页
155-161
