软骨源性形态发生蛋白1转基因细胞片的初步探讨
目的 探讨软骨源性形态发生蛋白1 (cartilage-derived morphogenetic protein 1,CDMP1)转基因细胞片的构建及其活性鉴定. 方法 取1月龄新西兰白兔骨髓分离培养BMSCs,取第3～6代细胞进行实验.实验分为3组,A组:腺病毒(adenovirus,Ad)-巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)-人CDMP1 (human CDMP1,hCDMP1)-内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转染BMSCs,B组:Ad-CMV-EGFP(空载体腺病毒)转染BMSCs,C组:未转染的BMSCs.倒置荧光显微镜观察3组细胞荧光表达情况,MTT法检测3组细胞增殖活力.将3组处于对数生长期的细胞接种于温度敏感性6孔板获得细胞片,行形态学及HE染色观察,RT-PCR及Western blot检测3组细胞片hCDMP1和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白表达,阿利新蓝染色检测糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)表达. 结果 倒置荧光显微镜下观察示转染细胞在72 h表达明亮荧光,转染效率达90％; MTT法检测示,3组细胞生长曲线基本呈S形,培养1～9 d吸光度(A)值比较差异均无统计学意义(P＞0.05).通过温度敏感性6孔板体外可成功收获完整的三维立体细胞片结构,RT-PCR及Western blot检测示,A组细胞片中hCDMP1和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白均呈阳性表达,B、C组均为阴性.HE染色和阿利新蓝染色示,A组纤维组织丰富,细胞外基质较多,蓝色异染颗粒多;B、C组细胞外基质相对较少,无明显特异性蓝染颗粒;A组GAG阳性染色面积明显低于B、C 组,灰度值明显高于B、C组(P＜0.05). 结论 hCDMP1基因转染的BMSCs细胞片能表达Ⅱ型胶原和GAG,具有成软骨活性,其克服了传统组织工程中细胞利用率低、支架异质性等缺点,有望构建出致密的组织工程软骨,为软骨组织工程进一步发展提供了新思路.
软骨组织工程、细胞片、软骨源性形态发生蛋白1、BMSCs、腺病毒基因转染
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Project of Liaoning Department of Science and Technology2013020126-228,2013020126-221;Project of Education Fund Item of Liaoning ProvinceL2010290;辽宁省科技厅基金资助项目2013020126-228、2013020126-221;辽宁省教育厅基金资助项目L2010290
2014-03-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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