神经元差速贴壁纯化及影响因素分析
目的 神经元纯化是各种神经细胞实验研究必不可少的实验步骤,但目前少见神经元纯化过程中各种因素对神经轴突影响的实验报道.探讨简便有效的背根神经节神经元(dorsal root ganglion neurons,DRGn)细胞纯化方法和神经元培养体系内相关因素对β3-tubulin阳性神经轴突生长状态的影响. 方法 取新生3d的SD大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)制成细胞悬液,根据玻片包被底物不同分为D-多聚赖氨酸(poly-D-lysine,PDL)组、PDL/层粘连蛋白(Laminin,LN)组和Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)组,分别差速贴壁10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min,倒置相差显微镜观察细胞贴壁情况,并采用免疫荧光染色观察各时间点DRGn细胞和非DRGn细胞贴壁数量.将DRG制备组织块培养72 h,采用完全随机设计的方法观察底物(PDL、PDL/LN、Col Ⅰ)、FBS(0、5%、10%)、五氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu,0、20、40 μmol/L)和阿糖胞苷(cytrambine,Ara-C,0、10、20 μmol/L)不同水平对DRG整节培养中β3-tubulin阳性轴突长度和单位阳性轴突分支末梢数量的影响. 结果 倒置相差显微镜和倒置荧光显微镜观察显示,细胞接种后即开始贴壁,贴壁10 min后移除细胞悬液仍可见DRGn细胞及非DRGn细胞贴壁生长.PDL组:贴壁10、30 min,神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)阴性(NSE~-)细胞数高于NSE~+细胞数(P<0.05);贴壁80、90、100 min,NSE~+细胞数大于NSE~-细胞数(P<0.05).PDL/LN组:贴壁10、20、30、40、50 min,NSE~+细胞数及NSE~-细胞数差异无统计学意义(P>0.05);贴壁60、70、80、90、100 min,NSE~+细胞数大于NSE~-细胞数(P<0.05).Col Ⅰ组:贴壁10～40 min,NSE~-细胞数大于NSE~+细胞数,但差异无统计学意义(P>0.05);贴壁70、80、90、100 min,NSE~+细胞数大于NSE~-细胞数(P<0.05).DRG整节培养72 h后,底物水平为PDL/LN时轴突生长分化最好,与PDL水平和Col Ⅰ水平比较差异有统计学意义(P<0.05);FBS为5%水平时β3-tubulin单位阳性轴突分支末梢数最大(P<0.05),但阳性轴突长度在0、5%和10%3个浓度水平比较差异无统计学意义(P>0.05);5-Fu在0浓度水平时β3-tubulin单位阳性轴突分支末梢数及阳性轴突长度均最大,与20、40 μmol/L浓度水平比较差异有统计学意义(P<0.05);Ara-C在0和10μmol/L浓度水平的阳性轴突分支末梢数相同,均高于20 μmol/L水平(P<0.05);而阳性轴突长度在10 μmol/L水平时最长,与0和20μmol/L浓度比较差异有统计学意义(P<0.05). 结论 将DRGn细胞悬液在PDL包被的玻片上差速贴壁30 min,再将悬液吸出进行接种培养,可在一定程度上起到分离纯化神经元细胞的作用.行DRG整节培养时,选择神经元专用培养基联合PDL/LN细胞培养底物和10 μmol/L Ara-C,可获得最理想的β3-tubulin阳性轴突生长分化效果.
背根神经节神经元、差速贴壁纯化、FBS、五氟尿嘧啶、阿糖胞苷、大鼠
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R338.2;R651.2(人体生理学)
2010-04-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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