重组人RNA聚合酶Ⅱ转录调节物12-Fc融合蛋白载体的构建和表达
目的 用pIRES2-EGFP-Fc载体构建重组人RNA聚合酶Ⅱ转录调节物12(MED12)-Fc真核表达质粒,转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达MED12-Fc融合蛋白,纯化和鉴定MED12-Fc.方法 根据GenBank中的序列信息,从基因组上扩增出人MED12基因第2、3和4外显子,并通过Overlap聚合酶链反应(PCR)拼接获得目的基因片段,以pIRES2-EGFP-Fc真核表达质粒为载体,构建重组人MED12-Fc真核表达质粒.使用脂质体瞬时转染293T细胞,48 h收集上清液,用酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定质粒的表达能力.表达质粒电转CHO细胞,通过G418抗性筛选及流式细胞仪荧光筛选,获得高表达的稳定细胞株.使用稳定细胞株培养表达人MED12-Fc融合蛋白,收集上清液,用Proein A亲和纯化柱纯化蛋白.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)检测蛋白质分子量.结果 通过DNA测序和瞬时转染表达鉴定,证实MED12第2、3和4外显子基因序列正确,成功获得重组人MED12-Fc真核表达质粒.通过电转化、G418及流式细胞仪荧光筛选,获得高表达重组人MED12-Fc的稳定表达细胞株.通过细胞培养,亲和层析纯化,获得高纯度的重组人MED12-Fc融合蛋白.结论 成功构建MED12-Fc融合蛋白的表达载体,获得高纯度的重组人MED12-Fc融合蛋白,为进一步研究MED12蛋白功能奠定基础.
RNA聚合酶Ⅱ转录调节物12、融合蛋白、表达载体
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Q782(基因工程（遗传工程）)
江苏省卫生厅面上项目;泰州市社会发展项目
2016-01-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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