产肌酸水解酶基因工程菌的构建
目的 构建肌酸水解酶的重组质粒并转化至大肠杆菌,研究其蛋白的表达及活性.方法 ①根据Genbank数据库已知的肌酸水解酶(黄杆菌U-188)的基因序列,由上海吉凯生物有限公司进行生物合成,得到肌酸水解酶基因片段b;②根据肌酸酶的基因序列设计引物,聚合酶链反应(PCR)扩增,进行双酶切的回收和纯化,与质粒GV296酶切后进行连接,构建重组质粒GV296-b,分别转化至大肠杆菌DH5a,筛选测序鉴定;③提取重组质粒GV296-b,转入至大肠杆菌BL21(DE3),进行菌液PCR鉴定;④工程菌GV296-b/BL21(DE3),向菌液中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导其蛋白表达,并制备粗酶液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分析;⑤将工程菌GV296-b/BL21(DE3)于含特定浓度肌酸的培养基中培养24 h,取培养液测定肌酸浓度.结果 ①成功构建重组质粒GV296-b,将上述重组质粒进行双酶切.电泳显示,目的片段大小约为0.783和1.212 kb,与理论值相符;②重组质粒GV296-b,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后实现高效表达.工程菌GV296-b/BL21(DE3)表达肌酸酶,具有肌酸酶活性,按基因序列图分析肌酸水解酶403个氨基酸,经SDS-PAGE分析酶蛋白的分子量约为43 kD.结论 成功构建的工程菌GV296-b/BL21(DE3)能高效诱导肌酸酶的表达,具有肌酸酶活性.
肌酸水解酶、基因工程菌、肌酸、肌氨酸
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Q814(生物工程学(生物技术))
湖南省自然科学基金13JJ3082
2016-01-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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