大鼠视网膜干细胞转染绿色荧光蛋白的实验研究

摘要：

目的 观察蛋白质粒转染大鼠视网膜干细胞后蛋白的表达及细胞生长、分化情况.方法 应用机械-酶消化法将出生10 d大鼠的睫状体组织制成单细胞悬液,并应用含20 μg/L表皮生长因子、20 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子和1×B27添加剂在无血清DMEM/F12培养基中培养.取第2代细胞应用免疫细胞化学染色检测神经干细胞特异性抗原神经巢蛋白(nestin)及细胞分裂增殖标志物5-溴脱氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)的表达.应用脂质体转染法将含有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的质粒pGCsilencerTM U6/Neo/GFP转染到RSCs内,转染后应用荧光显微镜观察细胞生长情况,转染后应用G418筛选,一周后对转染后的细胞应用含50 ml/L的胎牛血清的培养基进行诱导分化,并应用免疫细胞化学染色方法对于分化后的细胞进行神经元标志物神经元特异性烯醇酶(neurone specific enolase,NSE)、神经胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)检测.结果 原代细胞培养2 d后在培养基内可以观察到悬浮的折光性强的小细胞团,4-5 d后细胞团数量增多且体积变大,7-9 d后细胞传代,应用免疫细胞化学方法可检测到细胞表达神经标志物nestin及增殖标志BrdU,基因转染1 d后即可在细胞内观察到荧光的表达,于转染2-3 d后荧光逐渐增强并可维持较长时间.筛选一周时细胞基本均表达GFP.转染后细胞的生长特性未发生明显变化,在以血清为诱导条件下仍可分化出神经样细胞.诱导第7日免疫化学染色分别检测出神经元及胶质细胞标志物NSE及GFAP的表达.结论 来源于睫状区的大鼠视网膜干细胞经基因转染后可在一定时间内稳定表达,并且细胞增殖及分化未受到明显影响,实验为下一步进行RSCs内表达或抑制特定的目的 基因的实验研究奠定了基础.

关键词：视网膜干细胞、荧光蛋白、基因转染

所属期刊栏目：16

分类号：R774(眼科学)

在线出版日期：2013-04-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：2190-2193