人TIM-1和TIM-3mRNA实时SYBRGreenⅠ定量RT-PCR检测方法的建立

摘要：

目的建立实时SYBRGreenI定量RTPCR检测人TIM1和TIM3mRNA的方法.方法从人外周血单个核细胞提取的总RNA中逆转录扩增人TIM1和TIM3的cDNA,将将纯化的人TIM1和TIM3的扩增产物分别与pMD18TSimple载体进行连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析.纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR实验.结果建立了TIM1和TIM3基因基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,检测灵敏度达103拷贝,线性范围为103-107拷贝.阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系,线性相关系数分别为1.00和1.00,扩增效率分别为1.070和1.023,批内及批间变异系数<5%.熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰.结论我们成功建立检测人TIM1和TIM3的实时荧光定量PCR方法,为进一步研究人TIM1和TIM3功能奠定基础.

关键词：T细胞免疫球蛋白粘蛋白-1、T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3、RT-PCR、SYBRGreenI、基因表达、mRNA

分类号：Q813(生物工程学(生物技术))

在线出版日期：2012-10-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：1537-1541