CRISPR/Cas9技术构建的 ITGA2B c.2659C＞T(p.Q887X)无义突变的血小板无力症小鼠模型对血小板功能的影响

摘要：

目的:用CRISPR/Cas9技术构建稳定表达的ITGA2B c.2659C＞T(p.Q887X)无义突变的血小板无力症小鼠模型,并对其血小板膜表面糖蛋白αⅡbβ3的功能做进一步研究.方法:根据ITGA2B基因信息设计并合成针对c.2659C位置的供体寡核苷酸和gRNA载体并进行体外转录.将gRNA和Cas9 mRNA与供体寡核苷酸共注射到受精卵,并送回到代孕鼠输卵管中.鼠出生后进行PCR基因分型和序列分析,获得阳性F0鼠.阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代,获得经PCR和测序验证的F1代杂合型点突变GT小鼠,而后F1代小鼠通过彼此交配得到纯合型点突变GT小鼠以及对照组WT小鼠.通过检测小鼠鼠尾出血时间和隐静脉出血时间、血小板聚集功能、血小板表面αⅡbβ3的表达和功能,对该小鼠模型的表型进一步验证.结果:小鼠鼠尾出血实验表明,GT小鼠割尾后的出血时间较WT小鼠明显延长(P＜0.01).小鼠隐静脉出血实验与鼠尾出血实验结果一致,即割断隐静脉后,GT小鼠的出血时间较WT小鼠明显延长(P＜0.01).在胶原、凝血酶、二磷酸腺苷诱导的血小板聚集实验中,GT小鼠血小板聚集率较WT小鼠有明显降低(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05),表明GT小鼠血小板聚集功能受到明显抑制.流式结果显示,GT小鼠血小板表面αⅡbβ3的表达量较WT小鼠明显下降(P＜0.01),在凝血酶刺激后,诱导活化的血小板与纤维蛋白原的结合量较WT小鼠明显减少(P＜0.01).纤维蛋白原铺展实验结果显示,GT小鼠的血小板在纤维蛋白原上的铺展面积较WT小鼠显著缩小(P＜0.05).结论:应用CRISPR/Cas9技术成功建立了 ITGA2B c.2659C＞T(p.Q887X)无义突变的GT小鼠模型.该小鼠模型血小板聚集功能缺陷,符合血小板无力症的表现.

关键词：小鼠模型、血小板无力症、CRISPR/Cas9

所属期刊栏目：30

分类号：R558(血液及淋巴系疾病)

资助基金：中国博士后基金;江苏省自然科学基金;南通市科技计划指令性项目

在线出版日期：2022-05-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：559-564